高糖高脂喂養LDLR-/-小鼠動脈鈣化的研究

王曉來，孫子林

(東南大學附屬中大醫院 內分泌科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

高糖高脂喂養LDLR-/-小鼠動脈鈣化的研究

王曉來，孫子林

(東南大學附屬中大醫院 內分泌科，江蘇 南京 210009)

目的:研究高糖、高脂喂養LDL受體基因缺陷(LDLR-/-)小鼠的代謝及血管鈣化指標，探討糖尿病血管鈣化的相關機制。方法：高糖、高脂喂養LDLR-/-小鼠為實驗組(HF組)，常規飼養LDLR-/-小鼠為對照組(CON組)，喂養16周。實驗結束檢測兩組小鼠空腹血糖(FBS)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹胰島素(FIns)。流動注射分析法檢測血清糖基化終產物肽(AGE-P)，實時定量PCR分析小鼠主動脈MSX2、OPN、Cbfα-1、α-SMA mRNA表達，蘇木精-伊紅染色法(HE染色)觀察主動脈粥樣硬化病變，Von Kossa染色觀察主動脈鈣化病變。結果：與CON組比較，HF組小鼠血清FBS、FIns、穩態胰島素評價指數、CHO、TG、LDL、HDL、AGE-P水平顯著增高；HF組小鼠主動脈MSX2、OPN、Cbfα-1基因表達增加，α-SMA基因表達減少。光鏡下觀察，HE染色CON組主動脈未見動脈粥樣硬化病變，HF組主動脈可見動脈粥樣硬化。Von Kossa染色CON組主動脈未見鈣化，HF組主動脈可見鈣化。結論：高糖、高脂喂養可以加重LDLR-/-小鼠糖、脂代謝異常，繼而加速動脈鈣化。這一動物模型可用于糖尿病相關血管鈣化的研究。

動脈鈣化； 低密度脂蛋白受體基因缺陷小鼠； 糖尿病

既往認為血管鈣化是一個被動的、衰退的過程，但是近期多項研究顯示其是主動的、可被調節的過程，這是一個病理生理過程，同時具有胚胎期骨形成的一些特點。研究證實血管鈣化可通過多種疾病過程如高血壓、心肌梗死、心臟肥大、充血性心力衰竭、動脈狹窄、肢端缺血等危害血管壁并破壞其完整性，從而降低動脈、大動脈的彈性，并影響循環系統的血流動力學，使患者心血管疾病的發病率和死亡率明顯增加[1-3]。研究顯示冠狀動脈鈣化積分可用于預測未來心血管不良事件發生率[4-6]。深入性研究顯示，糖尿病患者的冠狀動脈鈣化發生率更高，且與脂代謝異常、胰島素抵抗及其他的心血管疾病危險因素相關[7-11]。

LDL受體基因缺陷(LDLR-/-)小鼠是1993年Ishibashi等采用基因工程技術從胚胎干細胞中建立的小鼠模型。純合子小鼠血清膽固醇水平很高，當給小鼠喂高脂飲食時，可達到大于2 000 mg·dl-1，而正常小鼠血清膽固醇為80～100 mg·dl-1。雖常規飲食飼養無動脈粥樣硬化生成，但它有別于單純飲食誘導的C57BL/6J小鼠模型，前者動脈粥樣硬化病變具有延展性，且與載脂蛋白E基因缺陷小鼠比較，LDLR-/-小鼠脂蛋白譜更近似于人類。

本研究旨在通過研究高糖、高脂喂養LDLR-/-小鼠的代謝及血管鈣化指標，探討糖尿病相關血管鈣化的相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

12周齡雄性LDLR-/-小鼠購自南京大學模式動物研究所，動物生產許可證編號:SCXK(蘇)2005-0002。常規飼料及高糖、高脂飼料購自江蘇省協同醫藥生物工程有限公司，高糖、高脂飼料成分為基礎飼料59.8%、豬油16%、蔗糖20%、蛋黃3%、膽固醇1%、膽鹽0.2%。

1.2 方法

1.2.1動物分組 12周齡SPF級雄性LDLR-/-小鼠經過適應性喂養1周后，隨機分為常規飼料喂養組即對照組(CON組，n=10)，高糖、高脂飼料喂養組即實驗組(HF組，n=10)。CON組給予常規飼料喂養，HF組給予高糖、高脂飼料喂養，分別喂養16周。

1.2.2處死及血液組織標本取材 實驗第16周末兩組LDLR-/-小鼠禁食8 h以上，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉，每只小鼠經摘取眼球取血標本，斷頸處死小鼠并摘取升主動脈至胸主動脈段，將標本一部分即刻提取mRNA，一部分放入4%多聚甲醛中固定，以制備石蠟切片。

1.2.3指標檢測 全自動生化儀檢測血清空腹血糖(FBS)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)，放免法檢測血清空腹胰島素(Fins)水平，通過公式計算穩態胰島素評價指數(HOMA-IR)，公式如下：HOMA-IR=FIns(μIu·L-1)×FBS(mmol·L-1)÷22.5。

1.2.4流動注射分析法檢測血清糖基化終產物肽(AGE-P) 取小鼠血清20 μl加入480 μl三氯醋酸(0.15 mol·L-1)的EP管，并加入100 μl氯仿，劇烈振蕩后將脂質抽提入有機相，離心10 min。吸取水層20 μl注入高效液相色譜儀進樣環，流動相流動速率穩定在0.5 ml·min-1，紫外檢測器設定波長280 nm測定肽的含量，熒光檢測器設定激發波長370 nm、發射波長440 nm測定AGE-P含量。

1.2.5實時定量PCR分析 Trizol提取組織RNA，按照Prime Script RT reagent試劑盒說明書進行操作，逆轉錄合成cDNA。應用特異性引物對逆轉錄產物進行定量PCR。擴增反應條件:95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，33個循環。以GAPDH為內標，以2-ΔΔCt法對目的基因進行定量分析。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)HF組-(Ct目的基因-Ct管家基因)CON組。用于基因序列擴增的引物序列見表1。

表1 用于基因序列擴增的引物序列

注:GAPDH為磷酸甘油醛脫氫酶，MSX2為成骨轉錄因子，OPN為骨橋蛋白，α-SMA為平滑肌肌動蛋白，Cbfα-1為核心結合因子α-1

1.2.6蘇木精-伊紅染色法(HE)染色 兩組LDLR-/-小鼠主動脈石蠟切片經常規HE染色后于光鏡下觀察組織學特點。

1.2.7Von Kossa染色 兩組LDLR-/-小鼠主動脈石蠟切片脫蠟至水化，蒸餾水沖洗后將切片浸入2%硝酸銀溶液中，強光直射20～60 min后蒸餾水充分洗滌，再將切片浸入2.5%硫代硫酸鈉溶液中1 min，蒸餾水反復洗滌充分后放入1%伊紅溶液復染約數秒鐘，蒸餾水洗滌充分。常規脫水透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 統計學處理

所有數據用SPSS 13.0統計軟件進行處理。計量資料以均數±標準差表示,兩組間均數比較，如方差齊采用t檢驗,如方差不齊采用t′檢驗;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 實驗結束兩組LDLR-/-小鼠的代謝指標檢測

見表2、3。

表2 兩組LDLR-/-小鼠的體重、FBS、FIns、HOMA-IR比較

a 與CON組比較，P<0.05

表3 兩組LDLR-/-小鼠的血脂比較

a 與CON組比較，P<0.05

2.2 實驗結束兩組LDLR-/-小鼠血清AGE-P檢測結果見表4。

2.3 實驗結束兩組LDLR-/-小鼠主動脈MSX2、OPN、Cbfα-1、α-SMA mRNA的表達見表5。

表4 兩組LDLR-/-小鼠的血清AGE-P比較

a 與CON組比較，P<0.05

表5 兩組LDLR-/-小鼠各指標的實時PCR檢測結果

a 與CON組比較，P<0.05

2.4 光鏡下兩組LDLR-/-小鼠主動脈石蠟切片HE染色結果見圖1。

2.5 光鏡下兩組LDLR-/-小鼠主動脈石蠟切片Von Kossa染色結果見圖2。

3 討 論

LDLR-/-小鼠是1993年Ishibashi等采用基因工程技術從胚胎干細胞中建立的小鼠模型。本研究選用基于C57BL/6小鼠為母本(野型)敲除LDLR-/-的小鼠。該小鼠與ApoE基因缺陷小鼠相比，脂蛋白譜更近似于人類，有利于將脂蛋白改變與人類動脈粥樣硬化與高脂血癥的關系進行推演；有助于觀察藥物干預后分析動脈粥樣硬化與高脂血癥以及兩者導致的心血管病理改變如心血管鈣化的臨床意義。

CON組動脈內皮細胞完整，中層平滑肌細胞排列整齊，呈長形或橢圓形，細胞質呈嗜酸性紅染。HF組內膜不完整，內膜下脂質沉積，可見大量泡沫細胞，并伴有平滑肌細胞和纖維基質成分的增殖，可見動脈粥樣硬化性斑塊。箭頭所指為動脈粥樣硬化斑塊

圖1 兩組LDLR-/-小鼠主動脈HE染色 ×200

CON組為陰性，未見鈣化。HF組可見黑褐色的鈣鹽呈顆粒狀至斑塊狀沉積于血管平滑肌層。箭頭所指為顆粒狀至斑塊狀沉積的鈣鹽

圖2 兩組LDLR-/-小鼠主動脈Von Kossa染色結果 ×100

本研究發現，與CON組比較，HF組小鼠血清FBS、FIns、HOMA-IR、CHO、TG、LDL、HDL、AGE-P水平均顯著增高。與LDLR-/-小鼠的遺傳背景及喂養高糖高脂飼料相關。與CON組比較，HF組小鼠主動脈MSX2、OPN、Cbfα-1的基因表達增加，α-SMA基因表達減少。既往研究顯示,在血管鈣化過程中血管平滑肌細胞發生表型轉變，由正常的表達α-SMA的收縮型向表達MSX2、OPN、Cbfα-1的成骨型轉化，從而啟動細胞的鈣化程序。在本研究中顯示與上述相同的表現，提示高糖高脂飼料喂養LDLR-/-小鼠可誘導主動脈平滑肌細胞發生表型轉變參與血管鈣化形成。光鏡下觀察，HE染色CON組主動脈未見動脈粥樣硬化病變，HF組主動脈發生動脈粥樣硬化。本研究顯示LDLR-/-小鼠存在糖、脂代謝及炎癥相關基因表達的異常，在高糖高脂飼料的誘導作用下可以自發地發生動脈粥樣硬化，這與以往的研究結果相一致[12]。Von Kossa染色顯示CON組主動脈無鈣化，HF組主動脈中層發生鈣化。提示高糖、高脂喂養可以誘導LDLR-/-小鼠主動脈鈣化，該結果與HF組存在嚴重糖、脂代謝紊亂有關。

糖尿病與血管鈣化的發生密切相關。2型糖尿病患者普遍存在脂代謝紊亂，有研究顯示糖尿病患者治療前即存在TG、LDL升高[13]。隨著糖尿病患病時間的延長，胰島素抵抗及糖毒性、脂毒性對β細胞的損害可加重胰島素分泌功能進行性減退。本研究中的動物模型符合2型糖尿病的上述特點，因為在糖尿病的發生、發展過程中同時存在著高血糖、AGE升高、肥胖、氧化應激、高胰島素血癥、炎癥反應、脂代謝紊亂、骨調節蛋白表達異常、細胞凋亡、脂肪因子、糖尿病腎病等多種病理過程，而上述情況可能直接或間接促進血管鈣化的發生、發展[14-21]。對于糖尿病動物模型的血管鈣化相關指標的研究，有助于探索防治糖尿病相關血管鈣化的措施。綜上，高糖、高脂喂養可以加重LDLR-/-小鼠糖、脂代謝異常，繼而加速動脈鈣化，這一動物模型可以用于糖尿病相關血管并發癥機制的研究。糖尿病相關血管鈣化的機制尚需更深入的研究證實。

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High-sugar，high-fat diet induced aortic calcification in low density lipoprotein receptor gene deficient mice

WANG Xiao-lai，SUN Zi-lin

(DepartmentofEndocrinology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To explore the mechanisms of diabetic vascular calcification by studying the indicators of metabolism and vascular calcification in the high-sugar， high-fat diet low density lipoprotein receptor gene deficient (LDLR-/-) mice. Methods: High-sugar， high-fat diet fed LDLR-/-mice was the experimental group (HF group) and conventional diet fed LDLR-/-mice was the control group (CON group). The two groups were fed for 16 weeks. At the end of the experiment， fasting blood glucose (FBS)， total cholesterol (CHO)， triglyceride (TG)， low density lipoprotein (LDL)， high density lipoprotein (HDL)， fasting insulin (FIns) were detected. Serum advanced glycation end product-peptide (AGE-P) were detected by flow injection analysis. The expressions of MSX2， OPN， Cbfα-1，α-SMA mRNA were analyzed by Real-time quantitative PCR. Aortic atherosclerotic lesions were observed by hematoxylin-eosin staining. Aortic calcified lesions were observed by Von Kossa staining. Results: Compared with CON group，the serum FBS， FIns， HOMA-IR， CHO， TG， LDL， HDL， AGE-P were significantly higher in HF group. The gene expressions of MSX2， OPN， Cbfα-1 increased， whileα-SMA decreased. Aortic atherosclerotic lesions were seen in HF group. HF group demonstrated aortic calcification by Von Kossa staining. No aortic calcification was showed in the CON group. Conclusion: The high sugar， high fat diet can increase the metabolism disorder of glucose and lipid in the LDLR-/-mice， and then accelerate aortic calcification. This animal model can be used to study the mechanisms of vascular complications associated with diabetes.

aortic calcification; low density lipoprotein receptor gene knock-out mice; diabetes

2015-04-15

2015-05-02

王曉來(1975-)，女，遼寧丹東人，副主任醫師，在讀博士研究生。E-mail:xiaolai75@163.com

孫子林 E-mail:sunzilin@hotmail.com

王曉來,孫子林.高糖高脂喂養LDLR-/-小鼠動脈鈣化的研究[J].東南大學學報:醫學版,2015,34(4):577-582.

R587.1； R-33

A

1671-6264(2015)04-0577-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．017