PHBV納米纖維對大鼠骨髓間充質干細胞向神經干細胞分化的形態學影響

沈旭,蔣贊利,吳小濤,張曉峰,謝鑫薈,肖倩茹,黃寧平,王野

(1.東南大學醫學院,江蘇南京 210009； 2.東南大學生物科學與醫學工程學院，生物電子學國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

PHBV納米纖維對大鼠骨髓間充質干細胞向神經干細胞分化的形態學影響

沈旭1,蔣贊利1,吳小濤1,張曉峰2,謝鑫薈1,肖倩茹2,黃寧平2,王野1

(1.東南大學醫學院,江蘇南京 210009； 2.東南大學生物科學與醫學工程學院，生物電子學國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的：探究聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)納米材料對大鼠間充質細胞向神經干細胞分化的影響，為PHBV納米材料與骨髓間充質干細胞(BMSCs)聯合移植治療脊髓損傷提供新的依據。方法：采用貼壁分離培養的方法分離純化大鼠BMSC，傳至3～4代后接種至PHBV納米纖維膜(定向與非定向)上，以接種至玻片上為對照組，倒置顯微鏡下觀察對照組細胞形態，待細胞與PHBV納米纖維膜融合(24 h)后，以維甲酸(RA)作為增殖及分化誘導因子對BMSCs進行增殖培養、分化誘導，1周后，實驗組采用4%多聚甲醛固定，應用電鏡觀察細胞形態，用Nestin抗體免疫細胞化學染色鑒定神經干細胞。結果：BMSCs與PHBV納米纖維膜有很好的相容性，加入RA誘導劑72 h 后細胞形態開始變化，胞體開始回縮，突起逐漸伸出。電鏡觀察下定向PHBV組的神經元樣細胞被顯著拉長，并且細胞沿定向纖維的方向伸展，非定向PHBV組與對照組的神經細胞則無明顯的拉長狀態。免疫熒光染色驗證均有Nestin陽性細胞表達。結論：定向納米纖維通過引導細胞骨架延伸從而對細胞形貌產生顯著影響。與非定向納米纖維相比，神經元樣細胞在定向納米纖維表面被顯著拉長。因此，我們認為定向納米纖維支架可能在神經組織工程中更有優勢。

骨髓間充質干細胞； 聚羥基丁酸戊酸共聚酯納米材料； 神經干細胞; 大鼠

聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)是聚羥基丁酸和聚羥基戊酸的共聚物，它在生物體內主要作為細胞的碳源和能源的貯存物質，具有生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學活性、修復骨缺損等許多優良特性[1]。除生物活性支架外，組織工程中另一個重要的挑戰就是種子細胞的選擇。骨髓來源的間充質干細胞是一種成體干細胞,具有多向分化潛能[2]。研究表明，在沒有化學和生物誘導成分條件下，骨髓間充質干細胞(BMSCs)在PHBV納米纖維膜上可以分化為成骨細胞[3]、成脂細胞及神經細胞[4]。本實驗就是對大鼠BMSCs在PHBV納米纖維膜上分化為神經干細胞進行研究，以了解PHBV納米纖維材料對細胞形態的影響，探討它們作為神經組織工程載體材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4周SD雌性大鼠6只(江蘇省實驗動物中心提供)，靜電紡絲制備定向與非定向PHBV納米纖維材料膜(東南大學生物醫學系仿生材料研究室提供),定向PHBV纖維直徑為(383±143)nm，非定向PHBV纖維直徑為(500±86)nm，孔徑為100～150 μm，孔隙率93%(圖1)。主要試劑: a-MEM培養液、DMEM低糖培養液、胎牛血清(hyclone)，維甲酸(RA)，兔抗巢蛋白(Nestin)。實驗儀器: 掃描電子顯微鏡(德國FEI公司)，倒置熒光顯微鏡(尼康)，共聚焦顯微鏡(Andor， Northem Ireland)。

a.定向納米纖維； b.非定向納米纖維

圖1 高壓滅菌后PHBV靜電紡絲纖維膜SEM照片

1.2 方法

1.2.1BMSCs的提取 將4周齡SD大鼠的脛骨和股骨分離出來，浸泡在75%的乙醇中，轉入超凈工作臺內，用培養液洗去骨表面的乙醇，沿骨垢剪掉骨的兩端，暴露出骨髓腔，用無菌注射器吸取10 ml細胞生長培養液(α-MEM，美國，添加10%的胎牛血清及1%的雙抗，美國)沖洗骨髓腔，將骨髓沖出轉移至25 cm2細胞培養瓶中，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2條件下培養。提取后培養24 h首次換液，以后每3 d換液1次。約1周后懸浮細胞經換液大部分被除去，貼壁生長的即為BMSCs。10 d后BMSCs達到80%融合，去除培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞后0.25%的無EDTA的胰酶37 ℃消化5 min，然后加入3 ml 培養液終止消化。吹打均勻后，細胞懸液以1∶2 傳代到新的細胞培養瓶中。

1.2.2PHBV納米纖維的處理 無菌條件下將制備好的PHBV膜從塑封袋中取出，平鋪于48孔板中，其中定向及非定向PHBV膜各占15孔，PHBV材料膜上用特質壓環固定，防止材料上浮，對照組孔板中平鋪玻片，每孔加200 μl培養基。接種前預浸泡24 h。

1.2.3BMSCs的接種 將BMSCs傳至第3代，按1×104個·ml-1接種至48孔板中，每孔加200 μl細胞懸液置37 ℃培養箱中培養。待細胞與PHBV納米纖維膜融合后將樣品從培養板中取出，輕輕地用PBS洗3次，用2.5%的戊二醛室溫下固定2 h，PBS洗1次后用梯度酒精脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)各10 min。樣品自然干燥，噴金后用SEM(Ultra plus，Zeiss，德國)觀察細胞的形態。

1.2.4BMSCs的誘導及分化 其余各孔吸除培養基，加入RA誘導液200 μl置于37 ℃培養箱中，72 h后觀察細胞形態變化，每隔3 d換1次液，至第6天時取出PHBV膜，多聚甲醛固定，使用電鏡觀察細胞在PHBV纖維膜上的生長形態。

1.2.5細胞免疫組化染色 取出的PHBV材料膜用PBS洗滌3次，每次3 min，4%甲醛PBS固定細胞, 3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶10 min，之后用山羊血清封閉。加入兔抗大鼠神經干細胞標記性蛋白Nestin(1∶100)特異性一抗，4 ℃濕盒孵育過夜，滴加試劑1。室溫孵育20 min，PBS洗3次，滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS洗3次，DAB溶液顯色，純水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片(具體方法參照美國GBI公司兔超敏二步法免疫組化試劑盒說明)。在免疫熒光顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 BMSCs的形態觀察

原代細胞接種1 d后開始貼壁增殖，2 d后首次換液去除未貼壁細胞。3～4 d后細胞進入對數生長期，呈集落樣生長，7 d左右可觀察到貼壁細胞逐漸增多，細胞排列成漩渦狀、網狀、輻射狀見圖2。

2.2 BMSCs在PHBV納米材料上的生長形態及黏附情況

電鏡下可觀察到細胞很好地黏附在PHBV納米纖維膜上。在定向PHBV納米纖維膜表面可以看到細胞沿纖維方向被拉長，還可以觀察到絲狀偽足沿著纖維的方向延伸，在非定向PHBV納米纖維膜上生長的BMSCs向四周伸展，主要呈現出三角形或梭形形貌。而且我們發現，非定向PHBV納米纖維膜相對于定向PHBV納米纖維膜表現出更好的細胞相容性(圖3、4)。

圖2 BMSCs在玻片上生長增殖圖

圖3 BMSCs在定向PHBV納米纖維膜上培養的SEM圖

圖4 BMSCs在非定向PHBV納米纖維膜上培養的SEM圖

2.3 誘導分化后細胞生長情況和形態變化及免疫熒光染色鑒定

傳至第3代的BMSCs加入含有RA的神經干細胞誘導液，72 h后在倒置顯微鏡下即可見少量細胞胞體開始回縮，邊緣變得不規整，突起逐漸伸出(圖5)。6 d后取出PHBV納米纖維膜，固定后置于電鏡下觀察，定向PHBV組的神經元樣細胞被顯著拉長，并且細胞沿定向纖維的方向伸展，非定向PHBV組與對照組的神經細胞則沒有明顯的拉長狀態，且細胞的突起多于定向組(圖6)。3組誘導6 d后均行Nestin抗體免疫細胞化學染色，可見3組均有Nestin抗體免疫陽性的表達，即神經干細胞的生成(圖7)。

圖5 BMSCs在玻片上誘導向神經細胞分化圖

a.神經細胞在定向PHBV納米纖維膜分化生長圖； b.神經細胞在非定向PHBV納米纖維膜分化生長圖

圖6 神經細胞在PHBV納米纖維膜上生長的SEM圖

a.定向PHBV； b.非定向PHBV； c.玻璃片

圖7 RA誘導BMSCs在不同材料上向神經方向分化免疫熒光染色圖

3 討 論

研究顯示BMSCs在體外培養、擴增后，誘導其向神經細胞方向分化并植入到受損的大鼠脊髓處，發現可促進大鼠的功能恢復，但是并沒有使功能恢復達到理想的結果[5]。結合文獻我們認為，雖然移植BMSCs可促進脊髓損傷的恢復，但是其植入的體內環境可能最終影響其分化，導致修復效果不理想[6-7]。我們設想為移植的BMSCs營造一個適合的三維環境，可促使其最大限度地發揮作用，我們猜想將BMSCs置入某種材料后植入脊髓損傷的區域，來觀察其對脊髓損傷的修復。

近年來組織工程技術發展日新月異，PHBV因為其良好的降解性和生物相容性被制作成了不同類型的支架用于組織工程領域[8]。在眾多支架材料中，通過靜電紡絲技術制成纖維的直徑分布可從數十納米到幾微米，可以很好地模擬細胞外基質，因此得到了越來越多的關注[9]。本實驗中，定向及非定向的PHBV納米纖維膜是通過靜電紡絲的技術獲得，制作過程中加入了PEO，提高了PHBV的可加工性，因此制成了直徑均勻、連續性很好的納米纖維膜[10]。除了支架，組織工程中另一重要因素便是種子細胞，通過實驗觀察可見BMSCs在PHBV納米纖維膜表面黏附和增殖明顯優于在玻璃片上，這是因為納米纖維膜有著更高的孔隙率、表面粗糙度和比表面積，這些結構特性可以使納米纖維能更好地和細胞黏附，促進細胞之間的通信、營養物質的交換以及新陳代謝作用[11]。Wei等[12]指出細胞在定向和非定向PHBV納米纖維膜上的黏附及活性也有差異，與定向PHBV納米纖維相比，非定向PHBV納米纖維表現出更好的細胞相容性，更能促進細胞的增殖，這可能是由于非定向PHBV納米纖維的表面空隙及粗糙程度比定向PHBV納米纖維更大，更易于細胞的黏附。將BMSCs接種于不同取向的PHBV納米纖維膜及載玻片上，待細胞與各組材料融合后，結合SEM觀察我們發現，生長于PHBV納米纖維膜表面時，細胞的絲狀偽足沿納米纖維的方向延展，且細胞形態與纖維的取向有關[4,13]。加入RA誘導劑后，分化生成的細胞形態也發生了顯著變化。在定向PHBV納米纖維膜表面的神經干細胞被顯著拉長，并且突起沿定向纖維的方向伸展，非定向PHBV組神經干細胞則無明顯的拉長狀態，突起則沿著纖維向四周伸展。細胞生長于定向PHBV納米纖維膜表面時，其長徑比也有顯著增加，Yang等[14]在納米溝槽基底和定向纖維上培養細胞的研究也得到了相同的結論，可能由于基底材料的接觸引導作用所致。因此，有特定排列的定向PHBV納米纖維膜更能控制BMSCs分化的神經干細胞的形態，使細胞沿著一定的方向生長，這與神經再生定向生長的性質符合。本研究結果表明定向PHBV納米纖維膜能引導細胞沿著一定方向生長，我們還需進一步利用RT-PCR檢測定向及非定向PHBV納米纖維膜對BMSCs分化率影響的差異，為PHBV材料和BMSCs聯合移植治療脊髓損傷提供體外依據。

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Morphological study on inducement and differentiation of nerve cells derived from rat BMSCs on PHBV

SHEN Xu1，JIANG Zan-li1，WU Xiao-tao1，ZHANG Xiao-feng1，XIE Xin-hui1，Xiao Qian-ru2，HUANG Ning-ping2，WANG Ye1

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.StateKeyLaboratoryofBioelectronics，SchoolofBiologicalScienceandMedicalEngineering，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To investigate the impact of PHBV nanomaterials on differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs)into neural stem cells，and to provide a new basis for the treatment of spinal cord injury with combined transplantation containing BMSCs and PHBV. Methods： BMSCs derived from rat bone marrow were used to investigate the effects of aligned(A-NF)and random—oriented(NF) PHBV nanomaterials on cell adhesion and differentiationinvitro， SEM was used to observe BMSCs. Results： After six days of adding in the RA medium，we can see cells extend along with the direction of orientation of the fibers. Neural stem cells were detected with immunostaining for Nestin.Conclusion： The A-NF PHBV has a significant effect on cell morphology by guiding the cytoskeleton extending，neural stem cells are significantly elongated on the surface of the A-NF PHBV compared with the NF PHBV.

bone marrow stromal cells; PHBV nanomaterials; neural stem cells; rats

2015-01-06

2015-03-18

沈旭(1988-)，男，安徽蚌埠人，在讀碩士研究生。E-mail：shenxu233@126.com

蔣贊利 E-mail:jiangzanli@126.com

沈旭,蔣贊利,吳小濤,等.PHBV納米纖維對大鼠骨髓間充質干細胞向神經干細胞分化的形態學影響[J].東南大學學報:醫學版,2015,34(4):531-535.

R681.5; R329.2

A

1671-6264(2015)04-0531-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04.008