多耐藥肺結核患者特異性細胞免疫失衡與調節性T細胞CD4+CD25+CD127low有關

范任華，向延根，楊勵，劉艷科，陳平圣，尹柯，許憶新，封文軍，傅滿姣，吳佳玲，王雷，齊志強，喻容，張婷

(1.長沙市中心醫院，湖南 長沙 410004； 2.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

多耐藥肺結核患者特異性細胞免疫失衡與調節性T細胞CD4+CD25+CD127low有關

范任華1，向延根1，楊勵1，劉艷科1，陳平圣2，尹柯1，許憶新1，封文軍1，傅滿姣1，吳佳玲1，王雷1，齊志強1，喻容1，張婷1

(1.長沙市中心醫院，湖南 長沙 410004； 2.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

目的:探討調節性T細胞CD4+CD25+CD127low、CD4+及CD8+T細胞在多耐藥結核患者中的免疫調節作用。方法:采取30例健康體檢者(HD)、30例非耐藥初治肺結核(S-TB)患者及30例多耐藥結核病(MDR-TB)患者2ml肝素抗凝外周靜脈血，經CD3、CD4、CD8、CD25、CD127流式抗體標記后Beckman流式細胞儀計數各組CD4+CD25+CD127low、CD3+、CD4+、CD8+百分比含量，計算CD4/CD8值。結果:MDR-TB組CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比含量明顯高于HD組與S-TB組(P=0.000)，MDR-TB組CD4+T細胞百分比含量明顯低于HD組與S-TB組(P<0.05)，MDR-TB組CD8+T細胞百分比含量與HD組與S-TB組相比明顯上升(P<0.05)，MDR-TB組CD4/CD8值明顯低于HD組與S-TB組(P<0.001)；線性回歸分析發現：HD組中CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比含量與CD3+、CD4+、CD8+T細胞及CD4/CD8值均無相關性(P>0.05)，非耐藥初治肺結核患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比含量與CD3+、CD4+T細胞無相關性(P>0.05)、與CD8+T細胞存在正相關(r=0.419，P=0.011)、與CD4/CD8值存在負相關(r=-0.519，P=0.002)，耐藥結核病患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比含量與CD3+T細胞無相關性(P>0.05)、與CD4+存在負相關(r=-0.476，P=0.004)、與CD8+T細胞存在正相關(r=0.638，P=0.000)、與CD4/CD8值存在負相關(r=-0.776，P=0.000)。結論:隨著肺結核病程的發展，外周血中CD4+CD25+CD127low調節性T細胞逐漸上調，特異性細胞免疫水平下調，二者之間存在相關性，調節性T細胞可能通過抑制結核患者特異性細胞免疫應答來影響肺結核病的進程。

調節性T細胞CD4+CD25+CD127low； CD4+T細胞； CD8+T細胞； 多耐藥肺結核

調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)CD4+CD25+CD127low是一群在胸腺內發育成熟的控制自身免疫反應和免疫耐受的T淋巴細胞[1]。Treg在免疫調節中發揮重要作用，成為近年來免疫學的研究熱點。Treg被認為參與多種腫瘤的免疫平衡狀態調節，一般認為Treg抑制患者特異性免疫的產生[2]。此外，Treg還與多種慢性感染性疾病的發生有關[3]。肺結核外周血中CD4+CD25+T細胞數量顯著高于健康對照且與患者的細胞免疫狀態相關，CD4+CD25+Treg在肺結核發生中可能起重要作用[4]。同樣，CD4+、CD8+T細胞的特異性在肺結核病的發生發展中發揮重要作用。然而，Treg、CD4+與CD8+T細胞在耐藥肺結核病發生中的作用以及它們之間的關系并未弄清楚。為了進一步弄清楚Treg在肺結核患者中的特異性細胞免疫調節作用，我們對30例健康體檢人群(HD)、30例非耐藥初治肺結核(S-TB)患者以及30例多耐藥肺結核(MDR-TB)患者外周血中Treg、CD4+、CD8+T細胞的免疫調節作用進行體外分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象選擇2013年11月至2014年9月長沙市中心醫院住院患者，MDR-TB組30例，其中男18例，女12例，平均年齡(47.2±14.2)歲；S-TB組30例，其中男20例，女10例，平均年齡(52.8±15.7)歲；HD 30例，其中男18例，女12例，平均年齡(46.7±14.3)歲。臨床診斷根據臨床癥狀、體征、X線胸片、CT掃描、痰菌檢查，均符合中華醫學會結核病分類與診斷標準[5]，S-TB病人、MDR-TB病人根據藥敏結果確診后采集外周血，HD組來源于經篩查身體各項指標正常的體檢人群，空腹采血。

1.2 試劑和儀器

采用Beckman-Coulter Epics XL流式細胞儀，CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5、CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE、IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE、溶血劑OptiLyse C均購自美國Beckman-Coulter公司。

1.3 方法

取2ml靜脈血，肝素抗凝，混勻，各取50μl全血于3支測定管，第l管加入IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE，第2管加入CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE單克隆抗體量均為20μl，第3管加入CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5組合抗體試劑20μl。標記抗體和抗凝血混勻，在室溫、避光15min后每管400μl溶血劑OptiLyse C溶解紅細胞1h，用側向散射光(SS)和前向散射光(Fs)圈門選取淋巴細胞群，統一設定流式細胞術收集淋巴細胞數量30000個為停止條件，以IgGl-FITC/IgGl-PE/IgGl-PC5為Treg同型對照。分別檢測CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+、CD8+T細胞百分比含量。

1.4 統計學處理

用統計分析軟件SPSS19.0對檢測結果進行分析，計量資料以均數±標準差表示、各組間差異比較分別用One-Way ANOVA分析，性別、年齡差異比較分別采用χ2檢驗、方差分析，CD4+CD25+CD127lowTreg與CD3+、CD4+、CD8+百分比含量以及CD4/CD8值之間的相關分析采用線性回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究隊列入組標準

納入標準：所有入組研究對象均無心、肝、腎等臟器合并癥及其他感染，無糖尿病、自身免疫相關性或免疫性疾病，3個月內未用過免疫抑制劑及激素等藥物。各組間性別、年齡比較差異無統計學意義(χ2=0.340，P=0.844>0.05；F=1.54，P=0.220>0.05)。

2.2 MDR-TB患者與HD及S-TB患者外周血CD4+CD25+CD127low Treg水平比較

MDR-TB組外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞總數的(10.63±3.85)%，高于 S-TB組的(7.17±2.94)%以及HD組的(3.03±1.07)%，差異有統計學意義(F=11.50，P=0.000)。

2.3 MDR-TB患者與HD及S-TB患者外周血CD4+、CD8+T細胞水平，CD4/CD8值比較

與HD組相比，S-TB組外周血CD3+百分比數量上升、MDR-TB組CD3+百分比數量下降，差異無統計學意義(P>0.05)；與HD組相比，S-TB組外周血CD4+百分比數量下降，差異無統計學意義(P=0.629>0.05)，MDR-TB組CD4+百分比數量明顯下降(P=0.022<0.05)；與HD組相比，S-TB組外周血CD8+百分比含量上調(P=0.05)，MDR-TB組CD8+百分比含量明顯上升，差異有統計學意義(P=0.007<0.05)；與HD組相比，S-TB組外周血CD4/CD8值下降，差異有統計學意義(P=0.027<0.05)，MDR-TB組CD4/CD8值明顯下降，差異有統計學意義(P=0.000)。見表1。

注：CD4+MDR-TB組與HD組比較，P<0.05； S-TB組與HD組比較，P>0.05; MDR-TB組與S-TB組比較，P<0.05。CD8+MDR-TB組與HD組比較，P<0.05； S-TB組與HD組比較，P=0.05; MDR-TB組與S-TB組比較，P>0.05。CD4/CD8值MDR-TB組與HD組比較，P=0.000； S-TB組與HD組比較，P<0.05; MDR-TB組與S-TB組比較，P>0.05

2.4 肺結核患者CD4+CD25+CD127low Treg與CD4+、CD8+細胞水平，CD4+/CD8+值之間的趨勢關系

通過對表1中的CD4+CD25+CD127lowTreg與CD3+、CD4+以及CD4/CD8值進行線性回歸分析，發現HD中CD4+CD25+CD127lowTreg 百分比含量與CD3+、CD4+、CD8+T細胞及CD4/CD8值均無相關性(P>0.05)；S-TB患者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量與CD3+、CD4+T細胞無相關性(P>0.05)，與CD8+T細胞存在正相關(r=0.419，P=0.011)，與CD4/CD8值存在負相關(r=-0.519，P=0.002)；MDR-TB患者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量與CD3+T細胞無相關性(P>0.05)，與CD4+存在負相關(r=-0.476，P=0.004)，與CD8+T細胞存在正相關(r=0.638，P=0.000)，與CD4/CD8值存在負相關(r=-0.776，P=0.000)。見圖1～3。

a.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD3+T細胞百分含量之間的相關性(r=-0.024，P=0.450)； B.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD4+T細胞百分含量之間的相關性(r=-0.09，P=0.317)； C.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD8+T細胞百分含量之間的相關性(r=0.019，P=0.459)； D.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD4/CD8值之間的相關性(r=-0.225，P=0.061)

圖1 HD外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD3+、CD4+、CD8+T細胞百分含量及CD4/CD8值之間的相關性

Fig 1 The correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+，CD4+，CD8+and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood of HD

3 討 論

T細胞是機體最重要的免疫細胞，其主要功能是介導細胞免疫和調節機體的免疫功能，外周血中T細胞亞群是反映機體細胞免疫狀態的指標。本研究結果表明:與HD組相比，S-TB組CD3+T細胞百分比數量略有上升可能是與S-TB患者初次感染結核菌引起CD3+T細胞細胞反應性擴增，而MDR-TB組患者外周血的CD3+T細胞百分比數量略有下降則有可能是耐藥結核病患者帶菌生存時與體內的CD3+T細胞凋亡消耗有關；與HD組相比，S-TB、MDR-TB組患者外周血的CD4+T細胞百分比數量下降(P<0.05)，表明結核感染會引起體內CD4+Th細胞下降；與HD組相比，S-TB、MDR-TB組患者外周血的CD8+T細胞百分比數量上升，這有可能有兩種情況：一是肺結核患者體內的細胞毒性CD8+T細胞反應性擴增以抵抗結核分枝桿菌的入侵，二是CD4+T細胞百分比數量下降導致的CD8+T細胞百分比數量升高；與HD組相比，S-TB、MDR-TB組患者外周血CD4/CD8值顯著下降，差異有統計學意義(P<0.001)。MDR-TB、S-TB患者外周血CD4+、CD4/CD8值顯著低于HD，提示肺結核CD4+Th細胞免疫功能受到抑制，細胞免疫應答能力下降；與HD組相比，MDR-TB較S-TB患者CD4/CD8值下降更顯著，免疫失衡進一步加重。

a.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD3+T細胞百分含量之間的相關性(r=0.161，P=0.197)； B.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD4+T細胞百分含量之間的相關性(r=-0.079，P=0.340)； C.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD8+T細胞百分含量之間的相關性(r=0.419，P=0.011)； D.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD4/CD8值之間的相關性(r=-0.519，P=0.002)

圖2 S-TB外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD3+、CD4+、CD8+T細胞百分含量及CD4/CD8值之間的相關性

Fig 2 The correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+，CD4+，CD8+and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood of S-TB patients

Treg CD4+CD25+CD127low是機體里一種負性調控因子，與自身免疫病[6]、腫瘤[7-8]以及慢性感染[9]免疫抑制有關。研究發現，外科切除治療空洞型MDR-TB后，Treg數量減少，表明Treg參與了MDR-TB疾病進程[10]。通過檢測MDR-TB、S-TB與HD組外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+T細胞、CD8+T細胞以及CD4/CD8值，發現MDR-TB組CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量明顯高于S-TB組與HD組，提示MDR-TB組患者機體受到的免疫抑制明顯強于S-TB組與HD組。健康人群的CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量與特異性細胞免疫CD3+、CD4+、CD8+以及CD4/CD8值不存在相關性。S-TB CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量與CD8+呈正相關，與CD4/CD8值呈負相關。隨結核病程的進展，MDR-TB組患者機體特異性細胞免疫逐漸失衡，CD4+百分比含量、CD4+/CD8+值明顯低于S-TB組與HD組，與CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量明顯呈負相關，CD8+百分比含量隨肺結核病程進展逐漸增高，與CD4+CD25+CD127lowTreg百分比含量呈正相關，提示肺結核患者的特異性的CD4+、CD8+T細胞免疫功能失衡，其免疫功能隨病情加重而下降，這可能與患者機體CD4+CD25+CD127lowTreg上調有關，Treg可能通過抑制性的細胞因子[11]、細胞接觸和誘導凋亡等方式發揮其免疫抑制的功能，進而間接抑制CD4+、CD8+T細胞免疫[12]。

a.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD3+T細胞百分含量之間的相關性(r=0.056，P=0.384)； B.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD4+T細胞百分含量之間的相關性(r=-0.476，P=0.004)； C.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD8+T細胞百分含量之間的相關性(r=0.638，P=0.000)； D.CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD4/CD8值之間的相關性(r=-0.776，P=0.000)

圖3 MDR-TB患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分含量與CD3+、CD4+、CD8+T細胞百分含量及CD4/CD8值之間的相關性

Fig 3 The correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+，CD4+，CD8+and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood of MDR-TB patients

綜上所述，CD4+CD25+CD127lowTreg在MDR-TB發生發展發揮重要的負調節作用，深入研究其與特異性免疫之間的關系或許對增強機體免疫力，預防肺結核[13]和攻克MDR-TB是一個潛在的幫助。

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The correlation of the deregulated specific cellular immunity and CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in the multi-drug resistant pulmonary tuberculosis

FAN Ren-hua1，XIANG Yan-gen1，YANG Li1，LIU Yan-ke1，CHEN Ping-sheng2，YIN Ke1，XU Yi-xin1，FENG Wen-jun1，FU Man-jiao1，WU Jia-ling1，WANG Lei1，QI Zhi-qiang1，YU Rong1，ZHANG Ting1

(1.ChangshaCentralHospital，Changsha410004，China; 2.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To study the role of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells， CD4+and CD8+T cells in patients with multidrug-resistant tuberculosis. Methods: 30 cases of healthy donors(HD)，30 cases of patients with susceptible primary tuberculosis(S-TB)，30 cases of patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis (MDR-TB)were involved. 2ml of peripheral venous blood was injected into heparin anticoagulation tube， labeled with the monoclonal antibody of CD3， CD4， CD8， CD25 and CD127. The percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells， CD3+， CD4+and CD8+T cells was counted by using Beckman flow cytometry(FCM)， and the calculation of CD4/CD8 was conducted. Results: The percentage of CD4+CD25+CD127lowT cells in MDR-TB patients was significantly higher than that in the HD group and in the S-TB group(P=0.000)， the percentage of CD4+T cells in MDR-TB group was significantly lower than that in the HD group and in the S-TB group(P<0.05)， and the percentage of CD8+T cells in MDR-TB increased significantly compared with that in the HD group(P<0.05)， the ratio of CD4/CD8 in MDR-TB group was significantly lower than that in the HD group and in the S-TB group(P<0.001). There was no correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+， CD4+， CD8+and CD4/CD8 in HD by using the method of linear regression analysis(P>0.05). In drug-susceptible TB patients， there was no correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+and CD4+(P>0.05)， a positive correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD8+(r=0.419，P=0.011)， and a negative correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and CD4/CD8 ratio(r=-0.519，P=0.002). In MDR-TB patients， there was no correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD3+(P>0.05)， a positive correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD8+(r=0.638，P=0.000)， and a negative correlation between the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells and the percentage of CD4+(r=-0.476，P=0.004) and CD4/CD8 ratio(r=-0.776，P=0.000). Conclusion: With the development of pulmonary tuberculosis， CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells gradually increase in the peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients， and specific cellular immunity levels decline， there is a correlation in them， CD4+CD25+CD127lowregulator T cells may inhibit specific cellular immune response in MDR-TB patients．

CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells； CD4+T cells； CD8+T cells； multi-drug resistant pulmonary tuberculosis

2015-01-26

2015-03-21

科技重大專項課題資助項目(2013ZX10005004-004)

范任華(1979-)，男，湖南隆回人，主管技師，醫學博士。E-mail：fanrenhua04@sina.com

向延根 E-mail：xiangyangen@126.com；楊勵 E-mail：yanglicszxyy@163.com

范任華,向延根,楊勵,等.多耐藥肺結核患者特異性細胞免疫失衡與調節性T細胞CD4+CD25+CD127low有關[J].東南大學學報:醫學版,2015,34(4):525-531.

R521

A

1671-6264(2015)04-0525-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．007