曲妥珠單抗-納米金探針的制備及對乳腺癌細胞的抑制作用

苗鳳真，劉琳，宋麗娜，周彥生，張宇，李蘇宜，3

(1.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學生物科學與醫學工程學院 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009；3.安徽省腫瘤醫院 腫瘤內三科，安徽 合肥 230031)

·論 著·

曲妥珠單抗-納米金探針的制備及對乳腺癌細胞的抑制作用

苗鳳真1，劉琳1，宋麗娜2，周彥生2，張宇2，李蘇宜1，3

(1.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學生物科學與醫學工程學院 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009；3.安徽省腫瘤醫院 腫瘤內三科，安徽 合肥 230031)

目的:構建新型曲妥珠單抗-納米金生物探針(herceptin-GNPs)，探尋納米靶向治療乳腺癌新方法。方法：采用檸檬酸三鈉還原法制備金納米粒子(GNPs)，通過靜電吸附作用偶聯曲妥珠單抗(herceptin)合成herceptin-GNPs；MTT法檢測GNPs、herceptin、herceptin-GNPs對HER2陽性乳腺癌BT474細胞體外增殖抑制作用；流式細胞術檢測BT474細胞凋亡率和周期變化；蛋白質印跡技術檢測p-AKT和Bcl-2蛋白表達。結果：GNPs水溶液澄清透亮，靜電吸附成功制備herceptin-GNPs探針。GNPs濃度在100 μg·ml-1及以下未顯示明顯抑制BT474細胞增殖作用。不同濃度herceptin和herceptin-GNPs對BT474細胞生長具有劑量依賴的抑制作用；與herceptin相比，herceptin-GNPs抑制作用更強。流式細胞術檢測顯示herceptin、herceptin-GNPs均誘導BT474細胞凋亡，阻滯細胞于G0/G1期，且herceptin-GNPs作用強于herceptin。herceptin、herceptin-GNPs均可下調抑凋亡蛋白Bcl-2表達，降低AKT的磷酸化水平，且herceptin-GNPs作用強于herceptin。結論：本研究合成的herceptin-GNPs具有良好的生物相容性，較herceptin抑制乳腺癌BT474細胞生長作用更強，可減少herceptin給藥劑量。herceptin-GNPs可能為HER2過表達乳腺癌的靶向治療提供新方法。

乳腺癌細胞； 人表皮生長因子受體-2； 曲妥珠單抗； 納米探針； 金納米粒子； 細胞凋亡

據最新數據統計，在世界范圍內乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率為29%、死亡率為15%，分別位于女性惡性腫瘤的第1和第2位[1]。女性乳腺癌的發病率和死亡率在我國也呈快速增長趨勢，目前發病率和死亡率分別位居女性惡性腫瘤的第1位和第6位[2-3]，嚴重危害女性身心健康。在所有乳腺癌患者中，20%～25%的患者人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽性，HER2屬于HER家族，HER家族由4類跨膜受體酪氨酸激酶組成，包括HER1、HER2、HER3、HER4，其中HER2在乳腺癌發生發展過程中起重要作用，其原癌基因位于17q21，編碼跨膜酪氨酸激酶活性的生長因子受體，包含胞外區、跨膜區和細胞內區域3部分[4]，通過與自身或其他HER家族受體形成二聚化，引起胞內區域磷酸化，主要通過PI3K/AKT生存信號通路及Ras/Raf/MEK/MAPK增殖信號通路等多種信號通路促進細胞增殖和細胞存活[5]。HER2陽性乳腺癌是一種復雜的侵襲性惡性腫瘤，與HER2陰性患者相比，預后差，生存期縮短，對化療和內分泌治療耐受等。曲妥珠單抗(trastuzumab，商品名：赫賽汀，herceptin)是針對HER2的高純度重組DNA衍生物的人源化單克隆抗體，是乳腺癌治療領域的第1個分子靶向藥物，herceptin與HER2胞外域結合后通過下列機制抑制腫瘤增殖：(1) 阻斷下游信號傳導，抑制細胞增殖及細胞存活；(2) 抗體依賴的細胞毒作用；(3) 促進HER2內化，阻止截斷型HER2的形成；(4) 增加細胞凋亡；(5) 抑制新生血管形成[6-8]。HER2陽性乳腺癌患者使用herceptin后顯著延長了無病生存期和總生存期，但herceptin致心功能降低發生率較高，尤其發生在既往使用過蒽環類化療藥物的患者上，還有部分患者在herceptin治療1年后會出現耐藥性，導致治療失敗。減少herceptin用量、降低毒副反應、提高療效亟待解決，探索高效低毒的納米載體偶聯herceptin進行靶向治療是一個新的研究方向。

隨著生物醫學的飛速發展，生物納米載體被廣泛應用于醫學領域。特別是金納米粒子(GNPs)由于其易合成、性能穩定、生物相容性好、表面易于偶聯生物分子等特征，在生物成像、生物傳感器、藥物運載及腫瘤診斷和治療等方面有重要作用[9-10]，已經成為納米生物醫學領域的研究熱點之一。

本實驗采用檸檬酸還原法制備直徑約40 nm的GNPs，通過靜電吸附與herceptin偶聯，形成曲妥珠單抗-納米金探針(herceptin-GNPs)，探討herceptin-GNPs對HER2陽性的乳腺癌BT474細胞生長的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株

人源化乳腺癌細胞株BT474細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑

herceptin購于美國羅氏公司，胎牛血清購于GIBICO公司;氯金酸、檸檬酸三鈉購于上海凌峰化學試劑有限公司;RPMI-1640培養基、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白含量檢測試劑盒、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒購于南京凱基生物公司;兔抗人磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、兔抗人β-肌動蛋白單克隆抗體購于Cell Signaling公司;RIPA裂解液、ECL化學發光試劑盒購于南京碧云天生物公司。

1.1.3主要儀器

透射電鏡(日本電子株式會社，JEM-200CX)，紫外分光光度計(日本島津公司UV-3600)，動態激光光散射儀(DLS)(Malvern儀器有限公司，RW 20 digital)，酶標儀(美國BioTek，ELx800)，流式細胞儀(美國BD公司，FACSCalibur)，Western電泳儀(美國BIO-RAD公司，164-5051)，凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司，Gel Doc XR)。

1.2 實驗方法

1.2.1GNPs合成和表征

將100 ml 0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰，快速攪拌同時滴加1 ml 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液呈紫紅色時停止加熱和攪拌，室溫冷卻得濃度為47.8 μg·ml-1(以Au計)的GNPs水溶液。檢測紫外-可見吸收光譜，水動力尺寸和zeta電位，并進行透射電鏡(TEM)檢測。

1.2.2herceptin-GNPs合成與表征

1.2.2.1確定herceptin最適偶聯量 采用鹽沉淀法，取6瓶0.1 ml抗體溶液，其中抗體含量分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg，每瓶均加入1 ml GNPs水溶液，混勻，室溫靜置15 min，每瓶加入1 ml 10% NaCl水溶液，靜置2 h后觀察顏色變化。

1.2.2.2herceptin-GNPs合成 取1 ml GNPs溶液調pH至9.5，緩慢滴加30 μg herceptin(30 μl，1 mg·ml-1)迅速振蕩混勻，靜置30 min，然后加入10% BSA溶液至終濃度為1%，封閉15 min制得herceptin-GNPs溶液；2 000 r·min-1離心20 min，吸出上清，超純水重懸探針，4 ℃保存。

1.2.2.3BCA法測定抗體偶聯量 取100 μl BSA未封閉herceptin-GNPs離心后的上清液，加入1 ml BCA檢測工作液，37 ℃水浴30 min，紫外-可見分光光度計檢測其562 nm處的吸光值，通過與標準曲線對比得到上清中的抗體量，換算出上清液中總抗體量，則偶聯抗體量為抗體總量減去上清液中抗體量。

1.2.2.4herceptin-GNPs的表征 取1 ml BSA未封閉的herceptin-GNPs溶液，檢測其紫外-可見吸收光譜，水動力尺寸和zeta電位，并進行TEM檢測。

1.3 細胞培養

BT474細胞采用含10%胎牛血清的完全培養基RPMI-1640，在37 ℃、體積分數為5%的CO2、飽和濕度的培養箱中培養,取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 MTT法檢測細胞增殖抑制

取對數生長期的細胞，調整細胞濃度1×105ml-1接種于96孔板，每孔100 μl，細胞貼壁后分別加入不同濃度herceptin-GNPs和herceptin作用于BT474細胞，設置對照孔和調零孔，設5個復孔，分別孵育24、48、72 h。孵育結束后每孔加入50 μl MTT溶液，繼續培養4 h，吸出上清，每孔加入150 μl DMSO，混勻。在酶標儀490 nm處測量吸光值(OD值)。細胞存活率計算公式：存活率=(加藥孔OD值-調零孔OD值)/(對照孔OD值-調零孔OD值)×100%。

1.5 Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測細胞凋亡

分別用濃度為1.25、2.5、5 μg·ml-1的herceptin-GNPs和herceptin作用于BT474細胞，48 h后消化收集細胞，洗滌后用500 μl Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻，再加入5 μl Propidium Iodide(PI)，室溫避光反應15 min，流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.6 PI單染法檢測細胞周期

分別用濃度為1.25、2.5、5 μg·ml-1的herceptin-GNPs和herceptin作用于BT474細胞，48 h后消化收集細胞，用體積分數70%乙醇4 ℃固定2 h，PBS洗去固定液。加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI混勻，4 ℃避光30 min后用流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.7 蛋白質印跡檢測p-AKT和Bcl-2蛋白表達

分別用濃度為1.25、2.5、5 μg·ml-1的herceptin-GNPs和herceptin以及12.5、25 μg·ml-1的GNPs作用BT474細胞，48 h后加入細胞裂解液，于冰上充分裂解30 min，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min。取上清測定蛋白含量后分裝，-20 ℃備用。取濃度等量的各組蛋白進行SDS-PAGE變性電泳，將蛋白轉移到PVDF膜，加入5%脫脂奶粉溶液封閉2 h后將PVDF膜與一抗稀釋液4 ℃孵育12 h，PVDF膜清洗后與二抗稀釋液室溫孵育2 h，清洗晾干。采用ECL顯色，拍照并用Gel-Pro32軟件進行灰度分析。實驗重復3次。

1.8 統計學處理

統計學變量以均數±標準差表示，采用GraphPad Prism 5.0進行統計學分析，兩組間進行t檢驗，多組間進行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 GNPs合成與表征

GNPs水溶液呈清澈透亮的紫紅色，TEM圖顯示GNPs呈近似圓形(圖1A)，單分散性良好，粒徑以40nm為中心呈正態分布(圖1B)，平均直徑為(42.1±4.5) nm，為進一步制備herceptin-GNPs提供良好的載體。

圖1 GNPs TEM圖(A,×450 000)以及GNPs粒徑分析圖(B)

Fig 1 The TEM image of GNPs(A,×450 000)and the size distribution histogram of GNPs(B)

2.2 herceptin-GNPs的合成和表征

2.2.1herceptin最適偶聯量

采用鹽沉淀法探尋最佳抗體偶聯量，在NaCl電解質液作用下，抗體在低于某一濃度時GNPs水溶液會產生聚集并沉淀而變藍。實驗發現抗體量為12.5 μg時探針溶液變藍(圖2)，抗體量25 μg為穩定GNPs的最低蛋白量，標記時蛋白最適保護量在此基礎上增加20%，為30 μg herceptin·(ml GNPs)-1。

圖2 偶聯herceptin最適量確定

Fig 2 Determination of the optimization amount of herceptin antibody

2.2.2herceptin-GNPs TEM表征

探針經磷鎢酸染色，可見GNPs表面包覆一層清晰的抗體薄層(圖3)。

2.3 GNPs與herceptin-GNPs的紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見吸收光譜(圖4)可見，GNPs紫外吸收特征峰為529.5 nm，herceptin-GNPs為536.5 nm，吸收峰紅移，并且吸收峰值降低，是因為GNPs表面吸附herceptin導致。

圖3 herceptin-GNPs TEM圖，箭頭指示herceptin吸附層

Fig 3 The TEM image of herceptin-GNPs，the arrow indicates the herceptin adsorption layer

圖4 GNPs與herceptin-GNPs紫外-可見光譜圖

Fig 4 UV-Vis spectrum of GNPs and herceptin-GNPs

2.4 GNPs與herceptin-GNPs水動力尺寸

DLS測得GNPs的水動力尺寸為(50.03±2.00) nm，大于TEM尺寸，是GNPs在水溶液中周圍形成水化層所致。zeta電位(-43.3±2.35) mV，表明GNPs表面帶負電，這是由于檸檬酸三鈉還原法制備的GNPs表面殘留檸檬酸根離子。herceptin-GNPs的水動力尺寸和zeta電位分別為(118.4±4.73) nm、(-28.43±3.26) mV，均大于GNPs的尺寸及電位，表明GNPs表面因偶聯herceptin，從而引起了探針尺寸及電荷的改變。

2.5 抗體偶聯量的測定

采用BCA法測量herceptin-GNPs中抗體偶聯量，以herceptin濃度計算，實驗重復3次，測得herceptin-GNPs中抗體的平均濃度為11.3 μg·ml-1，抗體偶聯率為37.67%，即每毫升GNPs水溶液可以與11.3 μg herceptin偶聯。

通過以上表征相互印證，證實了GNPs與herceptin成功偶聯，保證了探針的有效性。

2.6 MTT法檢測體外細胞增殖抑制

不同濃度GNPs作用于BT474細胞增殖抑制實驗顯示，100 μg·ml-1及以下濃度的GNPs對細胞增殖率無顯著影響(P﹥0.05)(圖5A)。探針中所用GNPs的濃度在50 μg·ml-1以下，此濃度GNPs具有良好的生物相容性。herceptin、herceptin-GNPs分別與BT474細胞作用48 h，可見兩者對其呈現劑量依賴的細胞毒作用，與單獨使用herceptin相比，在相同抗體濃度下herceptin-GNPs抑制細胞增殖作用明顯增強，差異有統計學意義(P<0.01,圖5B)。

a 與herceptin同濃度相比，P<0.01

圖5 不同濃度GNPs對BT474細胞活性影響(A)以及不同濃度herceptin-GNPs和herceptin對BT474細胞活性影響(B)

Fig 5 Effect of GNPs with different concentrations on viability of BT474 cells(A)and effect of herceptin-GNPs,herceptin with different concentrations on viability of BT474 cells(B)

2.7 herceptin和herceptin-GNPs對BT474細胞周期的影響

不同濃度herceptin作用BT474細胞48 h后阻滯細胞于G0/G1期，并隨著濃度增加阻滯在G0/G1期的細胞比例增多。經herceptin-GNPs處理后亦阻滯細胞于G0/G1期，且較單獨應用herceptin阻滯作用增強(P<0.05)，差異具有統計學意義(表1)。

2.8 herceptin和herceptin-GNPs對BT474細胞凋亡的影響

不同濃度herceptin作用于BT474細胞48 h，細胞凋亡率隨藥物濃度增大而增加。herceptin-GNPs處理細胞后細胞凋亡率較同濃度herceptin組明顯增加(P<0.05)，差異有統計學意義(表2、圖6)。

a 與對照組相比，P<0.05; b 與同濃度herceptin相比，P<0.05

與同濃度Herceptin比較，aP<0.05，bP<0.01

圖6 不同濃度herceptin-GNPs(A)和herceptin(B)作用48 h對BT474細胞凋亡率的影響

Fig 6 Apoptotic rate of BT474 cells under the different concentrations with herceptin-GNPs(A)and herceptin(B)for 48 h

2.9 蛋白質印跡檢測p-AKT蛋白和Bcl-2蛋白表達

蛋白質印跡檢測蛋白表達結果顯示，與對照組比較，低濃度的GNPs對HER2下游信號蛋白p-AKT及凋亡蛋白Bcl-2未見明顯影響，提示GNPs細胞毒性低。隨著herceptin、herceptin-GNPs濃度增加，AKT磷酸化水平降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降，顯示兩者均對PI3K/AKT信號通路有抑制作用，皆可誘導細胞凋亡，但herceptin-GNPs下調AKT磷酸化水平和降低Bcl-2表達水平高于herceptin，差異具有統計學意義(P<0.05，圖7)。

3 討 論

隨著生物醫學的快速發展以及多學科之間的相互交叉，生物醫學納米技術的進步為腫瘤靶向給藥帶來了革命性的變化。腫瘤血管新生過程是一種失去正常調控的無序過程，血管基膜間隙增寬，為200～800 nm，通透性增加，正常血管內皮間隙只有5～10 nm，且腫瘤組織缺乏正常的淋巴回流系統，因此這種大分子納米

圖7 不同濃度herceptin和herceptin-GNPs作用48 h對BT474細胞AKT磷酸化水平和Bcl-2蛋白表達影響

Fig 7 Western Blot analysis of expression of p-AKT and Bcl-2 in BT474 cells under the different concentrations with herceptin-GNPs and herceptin for 48 h

尺寸藥物優先穿過腫瘤血管進入腫瘤內部并選擇性累積，這種增強的滲透滯留效應稱為EPR效應(enhanced permeability and retention effect)[11]。herceptin靶向治療乳腺癌延長了患者生存期，然而herceptin致心臟毒性事件的出現限制了其應用。目前herceptin致心臟毒性的機制不清，可能是心肌細胞膜上存在HER2受體，與herceptin結合后抑制心肌細胞正常功能而導致心功能損害[12]。因此基于EPR效應，結合herceptin的主動靶向作用，通過GNPs偶聯herceptin減少用藥量、增加療效、降低毒副反應的方法成為研究熱點。

GNPs由于毒性低、生物相容性好、表面易于偶聯等性質，可用于藥物載體。本實驗合成的GNPs平均粒徑(42.1±4.5)nm，由于表面殘留有檸檬酸根離子而帶負電荷，通過靜電吸附作用與蛋白質的正電荷結合，并且吸附后不改變蛋白質分子的活性，不會導致蛋白質分子變性。本實驗通過靜電吸附作用將GNPs與herceptin偶聯合成herceptin-GNPs,通過吸收光譜、水動力尺寸、zeta電位和TEM檢測，證明GNPs表面成功吸附herceptin。實驗中GNPs濃度在100 μg·ml-1及以下，BT474細胞生存率無顯著變化，顯示良好的生物相容性。herceptin作用于HER2陽性的BT474乳腺癌細胞48 h，抑制率與藥物濃度呈正比，herceptin-GNPs在相同濃度下較herceptin抑制率顯著增加，差異具有統計學意義,后通過相關實驗證明herceptin-GNPs的抑制作用更好。相比herceptin單抗，herceptin-GNPs的重要特征是GNPs表面結合了多個herceptin單抗，形成了類似多價抗體的納米探針。通過herceptin主動靶向細胞膜HER2受體，多價探針提高了與HER2受體結合的親和力，HER2受體內吞的效率提高，通過多價抗體探針多重機制抑制細胞增殖，提高了herceptin-GNPs的治療作用。Jiang等[13]將herceptin與不同尺寸的GNPs偶聯，作用于HER2陽性的乳腺癌細胞株SK-BR3，結果顯示，GNPs的尺寸在40～50 nm時對細胞的抑制作用最好，進一步探討了可能機制，過小和過大的herceptin-GNPs誘導HER2受體內吞的效率下降，GNPs作為藥物載體具有尺寸效應。Rathinaraj等[14]將herceptin與29 nm GNPs偶聯，作用于HER2陽性的乳腺癌細胞SK-BR3，通過熒光顯微鏡觀察到細胞凋亡率顯著增加，推斷是因為受體介導的內吞作用增強，herceptin內吞效率提高，導致細胞凋亡率增加。本實驗合成herceptin-GNPs作用于HER2陽性乳腺癌細胞，在體外抑制腫瘤細胞增殖顯示了優越性，減少了herceptin劑量，提高了療效，說明herceptin-GNPs可能具有良好的醫用前景。

納米粒子獨特的生物學特性可作為藥物載體，在腫瘤診斷和治療中發揮越來越重要的作用，盡管大多數納米載藥處在臨床前研究階段，但已經有少數進入臨床試驗階段[15]，我們有理由相信納米載藥體系會給腫瘤治療帶來重大突破。本實驗只進行了體外實驗，缺乏體內研究支持，下一步計劃建立動物實驗模型，進一步探討herceptin-GNPs在體內的藥物代謝分布、毒性研究及抑制效果。

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Preparation of herceptin-gold nanoprobe and its inhibitory effect on breast cancer cells

MIAO Feng-zhen1，LIU Lin1，SONG Li-na2，ZHOU Yan-sheng2，ZHANG Yu2，LI Su-yi1，3

(1.DepartmentofOncology，ZhongdaHosptital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.SchoolofBiologicalScience&MedicalEngineering，KeyLaboratoryforBiomaterialsandDevices，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 3.TheThirdDepartmentofOncology，AnhuiProvincialCancerHospital，Hefei230031，China)

Objective： To construct an innovative biocompatible nanoprobe-herceptin-gold nanoparticles(GNPs)， and to explore new targeted therapies in breast cancer. Methods: GNPs were synthesized by the classic citrate reduction method and the herceptin conjugated to GNPs by electrostatic adsorption. Setting 5 concentration gradients of GNPs from 6.25 μg·ml-1to 100 μg·ml-1， herceptin and herceptin-GNPs from 0.625 μg·ml-1to 10 μg·ml-1along with their control group to detect the cytotoxicity by MTT assay. The apoptosis， cell cycle changes were detected by flow cytometry and the expressions of p-AKT and Bcl-2 protein were detected by Western Blot， respectively. Results: The GNPs aqueous solution obtained were fuchsia and clear. The GNPs showed no cytotoxicity under the designed concentration gradients， which displayed good biocompatibility. Herceptin and herceptin-GNPs both could suppress cell growth， induce apoptosis and block cell proliferation in G0/G1phase； the latter had better effect.Moreover， both herceptin and herceptin-GNPs could inhibit the expressions of p-AKT and Bcl-2 protein， and the latter had better inhibitory effect. Conclusion: The herceptin-GNPs are biocompatible. Compared with herceptin， the herceptin-GNPs have better inhibitory effect on HER2 overexpressing breast cancer cell proliferation， which can reduce the dosage of herceptin. It would provide a nanoparticle-based targeted delivery system for the treatment of HER2 overexpressing breast cancer．

breast cancer cells； human epidermal growth factor receptor 2； trastuzumab； nanoprobes； gold nanoparticles； apoptosis

2015-03-11

2015-04-09

江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金-重點研究專項)項目(BK2011036)

苗鳳真(1988-)，女，河南濟源人，在讀碩士研究生。E-mail:fengzhen_miao@163.com

劉琳 E-mail:wenyu811@126.com；李蘇宜 E-mail:njlisuyi@sina.com

苗鳳真,劉琳,宋麗娜,等.曲妥珠單抗-納米金探針的制備及對乳腺癌細胞的抑制作用[J].東南大學學報:醫學版,2015,34(4):507-513.

R737.9； R318

A

1671-6264(2015)04-0507-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．004