泰山白首烏HPLC指紋圖譜研究

劉政波，畢研文，陳寶芳，仉勁，張亞玉※

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112； 2．泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院中草藥研究所，山東 泰安 271000)

泰山白首烏(CynanchumbungeiDecne)為蘿雐科鵝絨藤屬植物，又名“白首烏”，泰山山脈為其主產(chǎn)區(qū)，泰山白首烏位列“泰山四大名藥”之首，是典型的藥食兩用植物，在民間具有悠久的藥用歷史，在泰沂山區(qū)，既是家喻戶曉的滋補(bǔ)良藥，也是珍貴的旅游商品之一，具有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)壯筋骨、益精血、安心神之功效。泰山白首烏含有苯乙酮、戟葉牛皮消苷和揮發(fā)油等多種對人體有利的次生代謝產(chǎn)物[1～3]，具有抗腫瘤、提高免疫力等特殊的醫(yī)療和保健作用[4，5]。

由于受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等因素的影響，不同產(chǎn)地泰山白首烏藥材所含成分有一定的差異，僅針對中藥材的某個有效成分進(jìn)行定性、定量分析，并不能有效地控制中藥材的質(zhì)量[6]。目前，指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥與天然藥物質(zhì)量的有效手段，能從整體上控制質(zhì)量[7，8]。本試驗對泰山白首烏藥材的指紋圖譜進(jìn)行了研究，以期對泰山白首烏藥材的質(zhì)量控制提供有效的方法。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(600E四元梯度泵、2996光電二極管陣列檢測器、中文Empowers色譜管理系統(tǒng)、四通道脫氣機(jī)，美國Waters公司)；SZ-93自動雙重蒸餾水器(上海亞榮化儀器廠)；FW177型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；KQ5200D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇(分析純，天津永大試劑廠)；水為二次蒸餾水。

11批泰山白首烏樣品來源見表1，樣品均經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)王建華教授鑒定為泰山白首烏。

表111批泰山白首烏樣品來源

Table1

Eleven batches of C.bungei Decne.sample source

2 方法

2.1 供試品溶液制備

精確稱量樣品粉末0.2g(40目～60目)，用甲醇定容至25mL容量瓶中，超聲提取30min，過0.22μm濾膜制得待測樣品溶液。

2.2 HPLC色譜條件

色譜柱：Symmetry-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；測定溫度：30℃；光電二極管陣列檢測器；檢測波長：200nm～400nm；進(jìn)樣量：20μL；梯度洗脫：甲醇(A)-水(B)，0min～40min，10%～40% A，40min～60min，40%～60% A。

2.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版對所得HPLC圖譜進(jìn)行圖譜匹配和相似度分析，選取峰面積大于1%的色譜峰進(jìn)行標(biāo)識，設(shè)置S4為參照圖譜，經(jīng)過多點校正，自動匹配，以中位數(shù)法，生成對照圖譜R，由匹配數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果得到共有峰，建立泰山白首烏HPLC指紋圖譜共有模式。

利用NTSYS-pc(2.1)對11個不同產(chǎn)地的7個供試樣品的HPLC圖譜共有峰匹配數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化(STD)處理，再計算各個OUT之間歐氏距離(Euclidean distance)，采用類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類。

3 結(jié)果與分析

3.1 泰山白首烏HPLC檢測波長的確認(rèn)

精密吸取泰山白首烏供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行操作，考察泰山白首烏供試品溶液在60min內(nèi)三維色譜分離情況，見圖1。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在檢測波長為265nm時，供試液有較多的色譜峰，并且各色譜峰能夠較好地分離，最終確定指紋圖譜的分析波長為265nm。

圖1 泰山白首烏樣品HPLC三維色譜圖

3.2 共有指紋峰的標(biāo)定

觀察11個泰山白首烏樣品甲醇提取物的檢測結(jié)果，比較其液相色譜圖，記錄其共有峰，選擇參照峰4號為S，測定其中7個共有峰相對峰面積和相對保留時間的比值，計算結(jié)果見表2和表3。

表2泰山白首烏指紋圖譜的相對峰面積值

Table 2 Relative peak area of HPLC fingerprint chromatogram of C.bungei Decne

表3泰山白首烏指紋圖譜的相對保留時間

Table 3 Relative retention time of HPLC fingerprint chromatogram of C.bungei Decne.

3.3 共有模式的建立和相似度計算

將11批藥材HPLC指紋圖譜的結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系2004版”，采用“中位數(shù)法”生成11批藥材的對照圖譜(圖2)。再將11批藥材的指紋圖譜與生成的對照圖譜相比較，得到各批藥材的相似度(表4和圖2)。從表4可以看出，與對照圖譜R相比，11批泰山白首烏樣品明顯可以分為3類：第1類相似度為0.9～1.0，有較高的相似度，分別為S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10；第2類相似度為0.8～0.9，相似度一般，為S3；第3類相似度為0.7～0.8，相似度不高，為S11。不同產(chǎn)地泰山白首烏相似度的散點見圖3，結(jié)果與表4一致。

3.4 評價模式的建立

選取不同產(chǎn)地的11批泰山白首烏作為建立指紋圖譜的樣品，并利用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版”進(jìn)行相似度評價，分析結(jié)果為11批樣品的相似度均大于0.7，確立共有峰7個(圖4)。且11批藥材共有指紋峰的相對保留時間的RSD值均小于0.1%，表明本試驗所建立的方法符合指紋圖譜技術(shù)的相關(guān)要求。但11批藥材共有指紋相對峰面積RSD值最高達(dá)到9.685%，說明各類藥材的化學(xué)成分及其相對含量還是有一定差別的，但差別并不是特別大。

圖2 泰山白首烏不同產(chǎn)地指紋圖譜及其共有模式

表411批泰山白首烏指紋圖譜的相似度

Table 4 Similarity of HPLC Chromatography fingerprint of eleven batches of C.bungei Decne.

圖3 不同產(chǎn)地的泰山白首烏相似度的散點圖

Fig.3ScatterdiagramofthesimilarityofC.bungeiDecne.fromdifferentplaces

圖4 不同產(chǎn)地泰山白首烏共有峰圖譜

Fig.4CommonpeakchromatogramofC.bungeiDecne.fromdifferentplaces

4 結(jié)論

在HPLC色譜中，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版，對所得11批泰山白首烏樣品HPLC圖譜進(jìn)行圖譜匹配和相似度分析，建立了泰山白首烏HPLC指紋圖譜共有模式。結(jié)果表明，11批泰山白首烏樣品明顯分為3類：第1類相似度為0.9～1.0，有較高的相似度，分別為S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10；第2類相似度為0.8～0.9，相似度一般，為S3；第3類相似度為0.7～0.8，相似度不高，為S11。同時，確定了11批泰山白首烏樣品的7個共有峰，且共有指紋峰的相對保留時間的RSD值均小于0.1%，表明本試驗所建立的方法符合指紋圖譜技術(shù)的相關(guān)要求。但11批藥材共有指紋相對峰面積RSD值最高達(dá)到9.685%，說明各類藥材的化學(xué)成分及其相對含量還是有一定差別的，但差別并不是特別大。

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