利用假單胞菌DS1001a降解聚3－羥基丁酸酯制備3－羥基丁酸

張春雨，李 凡，時東方，王雨萌，劉東波，夏紅梅，陳 珊

（1.東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024；2.長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

利用假單胞菌DS1001a降解聚3－羥基丁酸酯制備3－羥基丁酸

張春雨1，李 凡1，時東方2，王雨萌2，劉東波1，夏紅梅1，陳 珊1

（1.東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024；2.長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

利用單因素法和響應面中心試驗法對假單胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a降解聚3－羥基丁酸酯（PHB）制備3－羥基丁酸（3－HB）的條件進行了優化.結果表明，該菌株降解PHB制備3－HB的最適培養基條件為：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O；最適培養條件為：培養溫度40℃，裝液量150mL，接種量1%，初始pH值6.28，培養時間18h.優化后3－HB的質量濃度為1.555mg／mL，回收率為77.75%，是單因素優化后的1.56倍.

3－羥基丁酸；聚3－羥基丁酸酯；生物降解；條件優化

聚3－羥基烷酸酯（PHAs）是用生物發酵技術合成的脂肪族聚酯，其中最具代表性的是聚3－羥基丁酸酯（PHB），它具有與通用樹脂聚丙烯相類似的性質，能紡絲、壓膜和注塑成型等［1－2］.然而，PHB最突出的性能是具有完全生物降解性和生物相容性，這是許多化學合成高分子材料所不具備的.因此，PHB作為國際公認的生物降解材料，在工業、農業、醫藥和環保等領域具有廣闊的應用前景［3－4］.

項目組前期的研究發現，某些菌株能夠將PHAs降解到單體，特別是PHB降解后可生成3－羥基丁酸（3－HB）［5－7］.3－羥基丁酸具有手征性，可用于色譜分析，以分離光學異構體；還可作為藥物中間體，合成手性藥物［8］.目前的藥物研究中越來越多地集中在生產手性藥物上面，因為對病人來說手性藥物更安全、更有效，使用劑量更小［9］.3－羥基丁酸除了可以作為合成昂貴化合物的起始原料外，其本身也具有重要的生理作用，已有的研究表明3－羥基丁酸和許多生理疾病的發生及治療有著非常密切的關系［10－12］，表現出巨大的潛在藥用價值.

目前，合成手性羥基脂肪酸（3－羥基丁酸）的主要生產方法有化學合成法及化學降解法.化學方法直接合成3－羥基丁酸需要高溫、高壓的反應條件以及昂貴的手性金屬催化劑等；降解PHB生產3－羥基丁酸，需要耗費大量的有機溶劑、較長的反應時間和高純度的PHB作為起始物［8］，并極易產生消旋化.另外，Lee等利用基因工程菌，以葡萄糖作為碳源，采用體內生物酶法降解聚羥基脂肪酸酯獲得了3－羥基丁酸［13］，但是所需成本較高.

本研究利用一株具有較強PHB降解活性的假單胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a，在體外降解聚羥基脂肪酸酯以獲得3－羥基丁酸；同時，對該菌株在液體培養基中降解PHB獲得3－羥基丁酸的培養條件進行了優化，得到了3－羥基丁酸的高產條件.通過降解條件的選擇與優化，使PHB不是直接降解到二氧化碳和水，而是把降解產物控制在3－羥基丁酸，使其成為新的精細化工原料，以為高附加值處理消費后的PHAs一次性制品奠定理論基礎，并提供技術支撐.

1 實驗材料與方法

1.1菌種

假單胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a，一株經過誘變的具有PHB高降解活性的菌株，東北師范大學生命科學學院微生物實驗室保存.

1.2聚3－羥基丁酸酯（PHB）

PHB粉末，由天津國韻生物材料有限公司提供.

1.3 3－羥基丁酸（3－HB）

購于Sigma公司，用于標準曲線的測定.

1.4基本培養基

PHB，0.15%；Na2HPO4·12H2O，1.194%；KH2PO4，0.554%；NH4Cl，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；CaCl2·2H2O，0.000 5%.1×105Pa高溫蒸汽滅菌20min［5］.

1.5發酵液中單體含量的測定

將發酵液在4℃條件下12 000r／min離心20min；取上清，用1mol／L濃鹽酸調pH＝2.0；超濾離心管（截留相對分子質量3 000）4℃，12 000r／min離心20min，取膜下液進行高效液相分析.

高效液相條件：Shim－pack Vp－ODSC18柱（150mm×4.6mm），流動相為V（乙腈）∶V（水）＝15∶85，紫外檢測波長為210nm，進樣量20μL，流速1mL／min，柱溫10℃.

1.6菌株DS1001a降解PHB制備3－HB單體的單因素條件優化

對菌株降解PHB獲得3－HB單體的發酵條件進行優化.設定培養基中PHB含量分別為0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%；NH4Cl含量分別為0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；Na2HPO4·12H2O／KH2PO4含量比分別為0.73／0.28%，0.87／0.33%，1.02／0.38%，1.16／0.44%，1.31／0.49%；MgSO4含量分別為0，0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%.菌株培養條件：培養溫度分別為28℃，30℃，35℃，37℃，45℃；初始pH值分別為5，6，7，8，9；接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%；500mL三角瓶中裝液量分別為50，100，150，200，250mL.發酵18h后測定發酵液中單體的濃度.

1.7利用響應面方法優化設計

根據單因素條件優化結果，利用響應面分析法的中心組合試驗（CCD），以培養溫度、初始pH值、裝液量3個因素為自變量，分別為X1，X2，X3，以3－HB單體濃度為響應值Y，進行試驗設計.

利用軟件Design Expert Version 7.0對實驗數據進行分析，得到響應值Y與自變量X1，X2，X3的關系，回歸方程為

式中：a0是常數項；a1，a2，a3是一次項系數；a12，a13，a23是交互項系數；a11，a22，a33是二次項系數.

對回歸方程進行顯著性檢驗和方差分析，并對已回歸的方程求一階偏導，令其等于0，得到3－HB濃度最大時對應的最適條件，在該條件下進行驗證實驗.

2 結果與討論

2.1菌株DS1001a降解PHB發酵液中單體含量的測定

將3－HB標準品稀釋成不同濃度，使用高效液相檢測，在2min左右出現對稱峰（見圖1），繪制單體含量－峰面積圖（見圖2），該直線方程為y＝355 741x－16 922，r＝0.999 7.根據標準曲線方程可由高效液相色譜的單體峰面積計算得出樣品中3－HB的濃度.

2.2菌株DS1001a降解PHB制備3－HB單體的單因素分析

在基礎培養基的基礎上進行發酵，每隔6h取一次樣，測定發酵液中3－HB的質量濃度，繪制菌株產3－HB的時間曲線（見圖3）.由圖3可見，培養12～18h3－HB單體含量較高，因此，為方便取樣將培養時間定為18h.

2.2.1 培養基成分對制備3－HB單體的影響

對菌株產3－HB的單因素條件進行優化，圖4為培養基成分的優化結果，確定的最適培養基組成為：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O.

圖4 （A，C）的結果顯示，培養基中的碳源、磷源的含量對產物中3－HB的質量濃度有較明顯的影響.由圖4（B）可知，氮源在培養基中所需的含量較小，且對產物中3－HB質量濃度影響不大，推斷培養基中氮源的匱乏可能對菌株降解PHB生成3－HB的行為有一定的促進作用.另外由圖4（D）可知Mg2＋對產物中3－HB質量濃度的影響不成線性規律，在0.07%時濃度較高.培養基中還加入微量的Ca2＋，結果證明Ca2＋對3－HB的質量濃度并無明顯影響.

2.2.2 培養條件對制備3－HB單體的影響

圖5為菌株培養條件的優化結果，確定的最適培養條件為：培養溫度35℃，初始pH＝6，接種量為1%，裝液量200mL.其中，圖5（A）顯示了該菌株在一定溫度范圍內都表現了較好的PHB降解活性；圖5（B）和（D）顯示了pH值、裝液量對產物中3－HB的質量濃度都有較明顯的影響；圖5（C）顯示了接種量對產物中3－HB質量濃度的影響較不規律，較低和較高的接種量對菌株降解PHB獲得3－HB都有較積極的影響.

2.3利用響應面方法優化制備3－HB單體的條件

根據單因素條件優化實驗的結果，利用響應面分析法的中心組合試驗（CCD），以培養溫度、初始pH值、裝液量3個因素為自變量，分別設為X1，X2，X3.以產物中3－HB質量濃度為響應值Y，進行3因素5水平的試驗設計，每個自變量的5個水平如表1所示，以（－1.68，－1，0，1，1.68）進行編碼.中心組合試驗方案及結果見表2.

表2中，1—8是析因試驗；9—14是星點設計；15—20是中心點重復試驗，用來估算誤差.采用Design－Expert軟件對上表中的響應值及各因素進行回歸擬合，得到方程：

其中：Y為響應值，即產物中3－HB的濃度；X1，X2，X3分別代表培養溫度、pH值和裝液量.由F－test值判定回歸方程中各變量對響應值的影響是否顯著，概率P越小，則相應變量的顯著性越高.方差分析結果見表3.

方差分析的結果表明，該回歸方程中各變量對響應值的影響極顯著（P＝0.007 7），回歸方程的擬合成功.相關系數R2＝82.69%，說明響應值的變化有82.69%來源于所選變量，進而說明該方程能夠真實地表達各因素與響應值之間的關系.

回歸方程系數的顯著性檢驗結果見表4.由回歸方程系數顯著性檢驗可知，其中一次項X2＜0.01極顯著，二次項X22＜0.01極顯著.表明單因素中pH值對產物3－HB濃度的影響是極顯著的.

由響應面回歸分析和回歸方程擬合可以繪出響應面圖和等高線圖（見圖6—8）.

各因素對實驗結果的影響可以通過響應面的三維空間圖直觀地表現出來，圖中的曲面越陡峭，說明該因素對實驗結果的影響越大.變量之間的關系可通過等高線圖表現出來，等高線呈圓形，說明兩因素之間影響不顯著；呈橢圓形，說明兩因素之間交互作用較大.

另外，從圖中可以得到擬合曲面的最大值，從而確定各因素的最佳點，對回歸方程求一階偏導，并令其等于0，可以得到曲面的最大點，即預測的最優條件：溫度40℃，pH＝6.28，裝液量為150mL，預測產物中3－HB單體的質量濃度為1.225mg／mL.

2.4響應面驗證實驗

為驗證模型的準確性和效能，在響應面法預測的最優發酵條件下進行驗證實驗，3次重復.結果顯示，產物中3－HB的質量濃度可達到1.555mg／mL，與模型預測值1.225mg／mL吻合良好，從而證明了該模型的準確性.如表5所示，通過響應面試驗優化后發酵產物中3－HB的濃度是單因素優化后的1.56倍，為優化前的3.81倍.該結果進一步證明了用響應面法尋求最佳發酵條件是可行的.

計算3－HB的收率：用發酵后得到3－HB的量比上培養基中加入的PHB的量，即1.555mg／mL× 100mL÷0.2g等于77.75%.

3 結論

利用響應面分析法能夠直觀地表現各個變量之間的關系，以及變量和響應值的關系，是一種較好的多條件優化的方法.本文采用單因素條件優化和響應面分析法，對假單胞菌DS1001a降解PHB獲得3－HB的條件進行了優化.單因素條件優化的結果確定該菌株降解PHB獲得3－HB的最適培養基條件為：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O；最適培養條件為：培養溫度35℃，裝液量200mL，接種量1%，初始pH值6.0，培養時間18h.對培養溫度、初始pH值和裝液量3個變量進行響應面優化后，進一步確定的培養條件為溫度40℃，pH值6.28，裝液量為150mL.通過優化得到了較高濃度的3－HB，是優化前的3.81倍，其中響應面試驗優化是單因素條件優化后的1.56倍，獲得的3－HB的回收率達到77.75%.在已報道的生產3－HB的野生菌株中，該菌株可以利用PHB作為唯一碳源降解PHB為3－HB，并具有較高的產量，可以嘗試將該菌株應用于PHB材料的回收利用、再生產等.從生物循環的角度著手，將降解PHB的過程與生產3－羥基丁酸的過程結合起來，進一步實現生物資源的再利用，具有較高的商業價值和環保意義.

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Production of 3－hydroxybutyrate by Psedomonas sp.DS1001biodegraded polyhydroxybutyrate

ZHANG Chun－yu1，LI Fan1，SHI Dong－fang2，WANG Yu－meng2，LIU Dong－bo1，XIA Hong－mei1，CHEN Shan1
（1.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；2.The Cental Laboratory，Changchun Normal University，Changchun 130032，China）

Used a strain of Psedomonas sp.DS1001ato produce 3－HB by biodegrading PHB，single factor conditions and response surface designs were optimized.The experiments determined the optimal media conditions：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O.The optimal culture conditions：culture temperature 40℃，liquid volume 150mL，inoculum 1%，initial pH＝6.28，incubation time 18h.The optimized 3－HB concentration was 1.555mg／mL，the recovery was 77.75%，the optimization was 1.56times than before.Determine the yielding conditions by using the strain obtained 3－HB from biodegradation process.

3－hydroxybutyrate；polyhydroxybutyrate；biodegradation；optimization

Q 939.9 ［學科代碼］ 180·6150 ［

］ A

（責任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0111－08

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.021

2014－04－22

國家自然科學基金資助項目（31270164）；吉林省科技發展計劃項目（20130102062JC）.

張春雨（1988—），女，碩士研究生；通訊作者：陳珊（1955—），女，博士，教授，博士研究生導師，主要從事環境與資源微生物學研究.