2株人參生防真菌發酵液穩定性的研究

肖春萍，韓 梅，楊利民

（吉林農業大學中藥材學院，省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室培育基地，吉林長春130118）

2株人參生防真菌發酵液穩定性的研究

肖春萍，韓 梅，楊利民

（吉林農業大學中藥材學院，省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室培育基地，吉林長春130118）

采用含毒介質培養法及菌絲生長速率法，研究了2株人參生防真菌FSR－74和FSR－97發酵液的穩定性.結果表明：2株生防真菌發酵液的熱穩定性較弱，其發酵液在低溫下（≤40℃）抑菌活性穩定，在中高溫下（＞40℃）抑菌活性逐漸下降乃至失活；2株生防真菌發酵液的酸堿穩定性較差，在pH＜5或pH＞9的條件下其抑菌活性逐漸減弱；生防真菌FSR－74發酵液具有較強的紫外穩定性，但生防真菌FSR－97發酵液的紫外穩定性較弱；生防真菌FSR－74和FSR－97發酵液具有較好的低溫儲藏穩定性，室溫下隨儲藏時間的延長對人參病原菌的抑菌率均顯著下降；2株生防真菌發酵液抗胰蛋白酶穩定性較差；生防真菌FSR－74和FSR－97均具有良好的傳代穩定性.生防真菌FSR－74和FSR－97的代謝產物有較強的低溫儲藏穩定性，具有一定開發價值，在不同植物病害防治應用中應在合理的溫度、光照及pH范圍內使用.

人參；生防真菌；發酵液；穩定性

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是我國的名貴藥材，有“百草之王”的美譽.人參在中國、韓國、朝鮮、俄羅斯等國家均有大面積種植.其中，中國東北特別吉林省是人參的主產區，已成為當地的重要支柱產業之一［1］.人參的長期人工種植導致人參種質退化、病害嚴重，人參制品質量差、產量低.長期以來通過使用化學農藥等化學防治措施防治人參病害并未達到預期效果，而且化學農藥過量使用不僅會破壞土壤微生態環境，加重環境污染，也使有毒物質在參根內大量積累，降低了人參的使用安全性和商品價值［2］.因此，植物病害防治重點逐步轉向了生物防治和農業防治措施上.在農作物植物保護領域，利用作物的健株根際土壤篩選對病原菌具有顯著生防效果的土壤微生物，并制成微生物菌劑，這是生物防控研究的重要手段之一，也是有益微生物資源開發利用的重要途徑［3］.

真菌是一類具有巨大實用價值的微生物，其中已有許多類群被應用于植物病害的防治［4－5］，真菌中含有的多種抑菌活性物質逐漸受到人們的關注.真菌發酵產物施用時，會受到陽光、溫度、土壤的酸堿性等各種因素的影響，因此，真菌發酵產物在各種環境條件下的穩定性是評價該真菌是否有開發價值的重要指標之一［6］.熱穩定性、酸堿穩定性等也是微生物次級代謝產物開發的重要衡量依據［7］.本文從人參健株根際土壤中分離篩選出2株具有高效廣譜抑菌活性的生防真菌FSR－74和FSR－97，對其在熱、酸堿、紫外線等條件下的穩定性進行了研究，以為菌株FSR－74和FSR－97的進一步開發利用提供評價依據和實踐基礎.

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 供試菌株

人參生防真菌FSR－74和FSR－97，篩選自人參健株根際土壤.

1.1.2 供試靶標菌

選用5種引起人參真菌性病害的病原菌，分別為引起人參根腐病、銹腐病、黑斑病、立枯病及人參灰霉病的腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）、毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、人參鏈格孢菌（Alternaria panax）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），以上菌株均由吉林農業大學農學院植物病理實驗室分離、鑒定.

1.2實驗方法

1.2.1 人參生防真菌無菌發酵液的制備

將保存的人參生防真菌FSR－74，FSR－97菌株在PDA平板上分別進行活化，并用打孔器各取2個5mm菌餅分別接入到50mL的葡萄糖馬鈴薯液體培養基（PDB）中，25℃，170r／min振蕩培養48h，得到種子液；種子液以10%的接種量接入到100mL的PDB液體培養基中進行二次發酵，25℃，170r／min振蕩培養4d后獲得培養液；將培養液8 000r／min離心20min，上清液即為發酵液；發酵液經細菌過濾器（濾膜孔徑0.22μm）過濾獲得無菌發酵液.

1.2.2 生防真菌發酵液穩定性研究

（1）發酵液的熱處理.將2株生防真菌的發酵液分別于40℃，60℃，80℃，100℃和120℃條件下處理60min，每個處理3次重復.待自然冷卻后，以原發酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（2）發酵液的酸堿處理.將2株生防真菌發酵液用1mol／L HCI和1mol／L NaOH分別調整pH至3，5，7，9，11和13，靜置6h后，再分別將各發酵液的pH慢慢調至原發酵液的pH值7.2，每個處理3次重復.以原發酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（3）發酵液的紫外處理.將2株生防真菌發酵液置于30W紫外燈下（距燈管20cm）分別照射30，60，90，120和150min，每個處理3次重復.以原發酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（4）儲藏穩定性測定.將2株生防真菌發酵液分別置于室溫（25℃）和4℃冰箱內，保存1，8，15，22和29d，每個處理3次重復.以原發酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（5）抗胰蛋白酶K穩定性的測定.分別在2株生防真菌的1mL發酵液中加入5μL胰蛋白酶K溶液（質量濃度20mg／mL），充分混勻并置于37℃搖床中撫育2h，每個處理3次重復.以原發酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（6）傳代穩定性研究.將2株生防真菌在PDA平板上連續傳代10次，每隔7d傳代1次，觀察每代菌株的培養特征是否一致；采用含毒介質培養法測定各代菌株發酵液的抑菌活性，以第1代菌株發酵液為對照，每處理3次重復.

1.2.3 對人參病原菌抑菌活性的研究

采用含毒介質培養法及菌絲生長速率法［8］測定FSR－74和FSR－97菌株無菌發酵液對5種人參病原菌的抑菌作用.分別將FSR－74和FSR－97無菌發酵液與PDA培養基按1∶4的比例（體積比）混合，配制成含藥培養基，然后將5種人參常見病原菌菌餅分別置于相應含藥培養基中央，以混合無菌水作空白對照，5次重復，25℃下恒溫培養，6d后測量各人參病原菌菌落半徑并計算抑菌率.

抑菌率＝（對照菌落擴展半徑－處理菌落擴展半徑）／對照菌落擴展半徑×100%

1.3數據處理

所得實驗數據采用Excel和DPS 7.05軟件進行統計分析.采用單因素方差分析（Duncan’s新復極差法）進行生防真菌發酵液穩定性差異顯著性的檢驗.

2 結果與分析

2.1生防真菌發酵液熱穩定性

由圖1可知，人參生防真菌FSR－74和FSR－97發酵產物中的活性物質熱穩定性較差.菌株FSR－74和FSR－97的發酵液經過不同溫度處理后，隨處理溫度升高，其對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌、鏈格孢菌和立枯絲核菌的抑制率逐漸下降，但對灰葡萄孢菌的抑制作用影響不大.其中，菌株FSR－74發酵液經40℃處理后，對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌的抑菌率分別下降33.33%和31.41%；經60℃處理后，對立枯絲核菌的抑制率下降顯著；40℃～100℃處理時，對人參鏈格孢菌的抑制率影響不顯著；120℃處理60min后，對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌、人參鏈格孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率分別比對照下降了77.75%，46.64%，59.43%，50.70%和35.47%.菌株FSR－97發酵液經60℃處理后，對毀滅柱孢菌和人參鏈格孢菌的抑制率下降顯著，分別比對照下降了33.38%和45.26%；60℃～100℃處理時，對各人參病原菌抑菌率的影響不明顯；120℃處理60min后，對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌、人參鏈格孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率分別比對照下降了61.18%，74.43%，74.19%，54.64%和10.22%.處理結果說明，低溫條件下（≤40℃），兩株生防真菌發酵液的穩定性較高；中高溫條件下（＞40℃），兩株生防真菌發酵液中的活性成分容易分解或易失活；兩株生防真菌發酵液熱處理后，對灰葡萄孢菌抑菌率的影響較小，且菌株FSR－97的熱穩性優于FSR－74.

2.2生防真菌發酵液酸堿穩定性

由圖2可知，生防真菌FSR－74，FSR－97發酵液經中性條件處理后，其活性物質的穩定性較好，但經酸性及堿性條件處理后，其活性物質的穩定性變差，且隨酸堿強度的增大，對活性物質的影響增大.pH＝5或pH＝9時，兩株生防真菌發酵液對人參病原菌的抑菌率逐漸降低；在pH＝3時，菌株FSR－74發酵液對人參病原菌的抑菌率顯著下降了12.55%～77.87%，菌株FSR－97對人參鏈格孢菌、毀滅柱孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率顯著下降了30.67%～87.29%；在pH＝9時，菌株FSR－97發酵液對腐皮鐮孢菌的生長無抑制作用；而pH＝13時，菌株FSR－74發酵液對人參病原菌的抑菌率下降了54.21%～66.80%，菌株FSR－97發酵液對毀滅柱孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率下降了32.99%～90.70%.因此，兩株生防真菌在發酵液活性物質分離、純化及使用過程中，酸堿性強度應保持中性.

2.3生防真菌發酵液紫外穩定性

由圖3可知，隨紫外線照射時間的延長，菌株FSR－74的發酵液對5種人參病原菌生長的抑制率基本無顯著變化，說明生防真菌FSR－74發酵液對紫外線不敏感，有較強的紫外線照射穩定性.生防真菌FSR－97的發酵液對紫外線較為敏感，紫外線照射時間延長至150min后，對5種人參病原菌的抑制率下降了21.65%～61.29%，說明菌株FSR－97紫外穩定性較差，其發酵液在使用及保存時應盡量避光.

2.4生防真菌發酵液儲藏穩定性

由圖4可見，在4℃條件下，生防真菌FSR－74和FSR－97發酵液的儲藏穩定性較強；25℃儲藏22d后，FSR－74和FSR－97發酵液抑菌活性下降.29d時，菌株FSR－74的發酵液在4℃條件下，對人參鏈格孢菌、毀滅柱孢菌和灰葡萄孢菌的抑菌率下降了9.21%～33.56，對立枯絲核菌的生長無顯著的抑制作用；在室溫條件下，對5種人參病原菌的抑菌率下降了35.42%～82.34%.菌株FSR－97的發酵液在4℃條件下儲藏29d時，對5種人參病原菌的抑菌率下降了13.76%～61.39%；而在室溫條件下，對5種人參病原菌的抑菌率下降了22.42%～87.28%.因此，兩株生防真菌發酵液的低溫儲存穩定性較好，在低溫條件下，生防真菌FSR－74和FSR－97的發酵液能在29d之內保持較高的抑菌活性.

2.5生防真菌發酵液抗胰蛋白酶K穩定性

由圖5可見，兩株生防真菌的發酵液經胰蛋白酶K處理后，對5種人參病原菌的抑菌率顯著低于對照，說明生防真菌FSR－74和FSR－97發酵后產生的抑菌活性物質在酶處理后穩定性變差.

2.6生防真菌發酵液傳代穩定性研究

從各代培養特征看，FSR－74，FSR－97在連續傳代過程中的形態特征與原始菌株相同；從抑菌活性看，FSR－74，FSR－97經連續10次傳代培養后，其發酵液的抑菌活性基本不變（見圖6），說明生防真菌FSR－74和FSR－97具有良好的傳代穩定性.

3 結論

由于微生物農藥的低毒、高效等特點，利用生防微生物防治植物病原微生物已成為生物防治技術的重要組成部分［9］.目前真菌是研究、生產和應用最多的一類生防微生物.生防真菌在發酵過程中產生的次生代謝產物已被作為微生物農藥進行開發利用［6］.人參生防真菌FSR－74，FSR－97發酵液具有高效廣譜的抑菌活性，研究其代謝產物的廣譜性及穩定性，對評價其在植物病害防治中的開發利用價值有重要意義.

對生防真菌FSR－74和FSR－97發酵產物穩定性的研究結果表明：兩株生防真菌發酵液在低溫儲存、中性條件、使用溫度低于40℃及適量光照時，其抑菌活性穩定；使用及儲藏溫度高、光照強、pH偏高或偏低時，都會導致發酵液抑菌活性的下降或失活.有研究發現，生防真菌通過產生有抑菌活性的物質［10－11］或產生細胞降解酶［12］來抑制病原菌的生長，進而達到防治植物病害的目的.菌株FSR－74和FSR－97發酵液由于溫度、光照、酶及pH的影響，可導致活性物質成分改變或作用酶失活，進而喪失抑菌活性.因此，生防真菌FSR－74和FSR－97發酵液的制備及其在不同植物病害防治的應用時應在合理的溫度、光照及pH范圍內使用.另外，本實驗的發酵液為多種成分的復合體，不同條件對不同人參病原菌的抑菌穩定性影響不同，因此發酵液中有效成分的含量及分子結構還有待進一步的深入研究.

［1］ 楊利民，陳長寶，王秀全，等.長白山區參后地生態恢復與再利用模式及其存在的問題［J］.吉林農業大學學報，2004，26（5）：546－549.

［2］ 姜云，尹望，陳長卿，等.人參內生菌的分離及拮抗菌株的篩選［J］.吉林農業大學學報，2012，34（5）：517－521.

［3］ 孫卓，楊利民，馬秀杰，等.人參黑斑病拮抗細菌的分離篩選和鑒定［J］.吉林農業大學學報，2014，36（3）：276－281.

［4］ 趙連仲.生防毛殼菌的分離鑒定及其抗菌活性研究［D］.濟南：山東師范大學，2014.

［5］ 申光輝，薛泉宏，張晶，等.草莓根腐病拮抗真菌篩選鑒定及其防病促生作用［J］.中國農業科學，2012，45（22）：4612－4626.

［6］ 張麗萍，張貴云.微生物農藥研究進展［J］.北京農業科學，2000，18（4）：22－25.

［7］ 張少飛，李敏，邢志國，等.產抑菌物質SDLH菌株的鑒定及發酵產物穩定性研究［J］.生物技術，2009，15（9）：56－59.

［8］ 楊驍，李長田.人參內生生防真菌的篩選與鑒定［J］.東北師大學報：自然科學版，2013，45（4）：107－113.

［9］ 陳源，卜元卿，單正軍.微生物農藥研發進展及各國管理現狀［J］.農藥，2012，51（2）：83－89.

［10］ 董夏偉.煙草青枯病拮抗真菌的篩選、鑒定及活性產物研究［D］.揚州：揚州大學，2011.

［11］ 李梅.綠色粘帚霉代謝產物對柑橘青綠霉病生物防治的研究［D］.成都：四川農業大學，2010.

［12］ 楊春林，席亞東，謝華，等.哈茨木霉Th－30幾丁質酶的生產條件及對灰霉病菌的拮抗作用［J］.植物保護學報，2009，36（4）：295－300.

Study on stability of fermentation broth from two antagonistic strains of Panax ginseng

XIAO Chun－ping，HAN Mei，YANG Li－min

（Chinese Medicinal Material College，Co－constructing Cultivation Base－key Laboratory by Province and the MOST of Ecological Restoration and Ecosystem Management，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

By means of containing poisonous medium culture and mycelial growth rate method，the stabilities of fermentation broths from antagonistic fungi strains FSR－74and FSR－97of Panax ginseng were studied.The results showed that thermal stability of fermentation broths from FSR－74and FSR－97was stable less than 40℃and the activities were decreased gradually or lost in high temperature（＞40℃）.The pH stability of fermentation broths from FSR－74and FSR－97was poor，and its antimicrobial activity was weakened gradually in the condition of pH＜5or pH＞9.UV stability of FSR－74fermentation broth was stronger while weaker for FSR－97fermentation broth.The fermentation broths from FSR－74and FSR－97were stable when storing in low temperature.The inhibition rates of FSR－74and FSR－97fermentation broths against ginseng pathogens was decreased significantly with the extension of storage time when storing in room temperature.Meanwhile，the fermentation broths from FSR－74and FSR－97were astable to trypsin K，while the antimicrobial activity of fermentation broths had no significant changes when the two strains were transferred for 10 generations.The active substances fermented by FSR－74and FSR－97with better storing stability have a value for development.As well as the temperature，illumination and pH must be controlled in a proper range in the prevention and control of plant diseases.

Panax ginseng；pathogenic fungi；fermentation broth；stability

S 432.2 ［學科代碼］ 210·60 ［

］ A

（責任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0105－06

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.020

2014－09－27

國家科技支撐計劃項目（2011BAI03B01－02）；國家自然科學基金資助項目（31270371）；吉林省科技發展計劃重點項目（20125068）.

肖春萍（1985—），女，博士研究生，主要從事藥用植物、土壤微生物區系變化研究；通訊作者：楊利民（1963—），男，博士，教授，博士研究生導師，主要從事藥用植物資源開發與利用研究.