山核桃種子脂肪代謝期EST序列的初步分析

黃銀芝，曾燕如，周 秦，夏國華，黃有軍

山核桃種子脂肪代謝期EST序列的初步分析

黃銀芝1,2，曾燕如1，周 秦3，夏國華1，黃有軍1

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省黃巖區頭陀鎮人民政府 農業辦公室，浙江黃巖318026；3.浙江省金華市農業科學研究院，浙江金華321017）

山核桃Carya cathayensis為重要的油料干果樹種，其非同一般的高含油率必定有其特殊的成油機制。為探索其成油機制，在已構建的山核桃脂肪代謝相關cDNA文庫基礎上，對cDNA進行隨機克隆測序，對序列進行拼接、功能注釋，基因本體論（gene ontology，GO）分類及基于擬南芥Arabidopsis thaliana的FunCat分類，并對與脂肪代謝相關的全長cDNA序列進行蛋白性質分析。結果共得到1 010條山核桃表達序列標簽（ESTs），經拼接獲得188個編碼蛋白質的基因（unigene），其中92個contigs和96個singlets。GO分類將這些unigene分成細胞組分、分子功能和生物過程等3類，并發現各序列編碼的基因并不承擔單一的功能，有些序列在功能上有重疊；同時參照擬南芥的基因功能分類，將unigene序列在功能上分成9類，得到了143個全長cDNA序列，其中包括14個與脂肪代謝相關的cDNA序列。對12個與脂肪代謝相關的全長cDNA序列進行蛋白性質分析，發現它們均具有磷酸化位點；除油質蛋白外都沒有跨膜區域，且不具信號肽結構，為非分泌蛋白，屬于某個蛋白家族；不同的油體蛋白具有不同的跨膜區，且均具有信號肽結構，屬于Oleosin super family蛋白家族。表4參35

經濟林學；山核桃；表達序列標簽；功能分類；脂肪代謝；蛋白分析

山核桃Carya cathayensis是胡桃科Juglandaceae山核桃屬Carya的木本油料樹種，其種仁的含油率平均達到70%，遠遠超過油菜新品系 “超油2號”Brassica napus‘Superoil No.2’（52.8%）［1］，為高含油量的樹種，是中國特有的名優干果。油料樹種的成油途徑及機制雖有共性，但不同的物種又有各自的特異性。山核桃非同一般的高含油率必定有其特殊的成油機制。表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）是從已構建的cDNA文庫中隨機挑取克隆，對cDNA進行測序得到的序列［2-4］。由于cDNA由mRNA反轉錄而來，mRNA是基因表達的產物，因而EST代表生物體某種組織某一時期的基因表達，也即具有時空性的特點。EST分析有助于認識生物體生長發育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生理生化過程［5］，目前主要用于發現新基因、了解基因表達概況等，是獲得未知基因、發現新基因及開發表達序列標簽-簡單重復序列（EST-SSR）分子標記相對快速、簡便的方法。在利用EST進行成油機制研究方面，對薄荷Mentha×piperita腺毛的EST進行了功能分析，以此來研究薄荷油的生物合成與分泌［6］；對4個時間點正在發育的蓖麻Richinus communis，歐洲油菜Brassica napus，衛矛Euonymus alatus，旱金蓮Tropaeolum majus種子EST進行深度測序，并對獲得的序列進行比較分析發現，4物種在油脂儲存的組織、光合能力及三酰甘油酯（triacylglycerols，TAGs）的結構與含量上彼此有差異，但編碼脂肪酸合成核心酶的基因EST是十分保守的，在種子發育過程中與發育時間緊密相關，參與甘油酯及其前體合成的基因表達具有明顯的物種特異性［7］；對擬南芥Arabidopsis thaliana碳水化合物到種子油脂代謝途徑的EST研究發現，許多基因是在種子中特異表達的［8］；研究人員早就注意到，催化脂肪酸代謝類似反應的酶，其基因EST豐度水平在統計學上存在顯著的差異［9］；對高油油棕Elaeis guineensis及低油耶棗Phoenix dactylifera的對比研究發現，784個轉錄因子中僅有6個轉錄因子EST水平2物種相差15倍，其中WRI1-like的EST水平油棕比耶棗要高57倍，它控制油脂合成與參與種子發育的上游因子無關，參與了不同的調控網絡，該網絡可能是棕櫚果實所特有的［10］。近年來，隨著實驗技術的發展，儀器設備的更新換代，研究人員對數種油料作物開展了成油相關的轉錄組學研究，如油茶Camellia oleifera［11］，油棕［10］和麻風樹Jatropha curcas［12］等，研究結果相對于cDNA文庫的測序結果序列短，數據量大，多集中在基因差異表達及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）途徑等。山核桃無類似的研究報道，僅報道了山核桃成油相關cDNA文庫的構建［13］。本研究是在構建山核桃種子脂肪代謝相關cDNA文庫的基礎上，對cDNA測序所得的EST序列進行分析的結果，以期為后續深入研究山核桃成油機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

基于周秦等［14］發現的山核桃油脂形成、轉化、積累的關鍵時期，黃銀芝等［13］構建了山核桃脂肪代謝相關的cDNA文庫。該文庫隨機測序所得EST序列即為本文的原材料。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的克隆測序 參照SmartTM cDNA library construction kit user manual（Clontech公司）的描述，制作測序平板，并隨機挑取1個λ噬菌體克隆，在重組噬菌體中經過活體剝離及完整質粒的環化，將λ噬菌體λTriplEx2克隆轉化成質粒載體pTriplEx2的克隆，并轉化大腸埃希菌Escherichia coli。轉化子培養后，分別用 pTriplEx2測序引物（5′sequencing primer TCCGAGATCTGGACGAGC/3′sequencing primer TAATACGACTCACTATAGGG）直接對菌液進行PCR［10］，檢測cDNA片段的大小，并進行菌液保存。將經過cDNA片段大小檢測過的菌液，送上海生物工程有限公司，用T7（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和pTriplEx2測序引物（5′-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3′）進行測序。

1.2.2 數據處理與拼接 利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）的在線軟件VecScreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）去除測序結果中的載體序列，利用DNAstar軟件中的SeqMan模塊去除冗余序列及小于150 bp的EST序列，余下的高質量序列用SeqMan模塊中的Progress方法進行聚類拼接，生成編碼蛋白質基因（unigenes），包括contigs和singlets。

1.2.3 功能注釋 對得到的unigenes，先后在NCBI的非冗余蛋白數據庫進行Blastx比對（序列對齊值大于80且序列同一性大于35%）［15－16］，在非冗余核酸數據庫進行Blastn比對（序列對齊值大于200且序列同一性大于75%）［17］。同時，用基因本體論（gene ontology，GO）分類，并參照Bevan［18］對擬南芥基因組研究的方法，對獲得的功能已知的cDNA片段進行分類。

1.2.4 全長cDNA序列的獲得 利用Blastx與其他生物已知的對應基因進行比對，將包含經ORF finder （open reading frame finder）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測且含有ORF（開放閱讀框）的cDNA視為全長cDNA。

1.2.5 序列提交GenBank數據庫 將序列轉化為通用的FASTA格式，再利用Sequin軟件（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/index.html）將序列轉化為GenBank提交格式，并提交GenBank。

1.2.6 山核桃脂肪代謝相關全長cDNA序列的蛋白分析 對獲得的參與脂肪代謝的全長cDNA序列進行蛋白分析。利用BioEdit軟件和瑞士生物信息學研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）ExPASy服務器（http://www.expasy.org/）上的ProtParam程序分析蛋白的分子量、等電點、氨基酸組成等。利用ExPASy服務器上的ProtScale程序對蛋白疏水性進行分析。利用丹麥科技大學（DTU）CBS服務器（http://www.cbs.dtu. dk/services）上的NetPhos 2.0 Server程序、TMHMM Server 2.0程序和SignalP 2.0程序分別對蛋白的磷酸化位點、跨膜區和信號肽位點進行分析。利用日本國家基礎生物學研究所的PSORT II程序（http://psort. nibb.ac.jp/form2.htm1）對蛋白做亞細胞定位分析。用美國國家生物技術信息中心（NCBI）的Conserved Domain Database（CDD）程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）預測該蛋白的保守結構域。

2 結果與分析

2.1 非冗余EST序列的獲得

隨機測序得到1 010條山核桃EST，去除低質量的序列和載體污染序列，經DNAstar軟件拼接后獲得188個編碼蛋白質基因（unigenes），其中92個contigs和96個singlets，序列總長度為201.131 kb，平均長度為1 069.84 bp。

2.2 功能注釋

將unigenes進行Blastx分析和ORF預測，確認序列包含完整的CDS區，獲得全長cDNA序列。經分析，188條單一序列中共143個全長cDNA序列。將unigenes序列與NCBI的非冗余蛋白質數據庫及非冗余核酸數據庫比對，提取有高度同源性的注釋信息，獲得功能注釋的序列175條。對這些有功能注釋的序列再進行功能分類。

2.2.1 GO（gene ontology）分類 基因本體論GO從基因參與的生物過程、所處的細胞位置、發揮的分子功能等3方面描述基因及其產物的功能。175條序列經分析分別歸入細胞組分、分子功能和生物過程3類（表1），且發現各序列編碼的基因并不承擔單一的功能，有些序列在功能上有重疊。細胞組分、分子功能和生物過程3類又可以分成不同的亞類，發揮不同的功能（表1）。

2.2.2 基于擬南芥基因功能的分類（MIPS functional catalogue） 根據所參與的細胞過程將cDNA序列分為8類（表2），分別是能量代謝（energy），細胞結構（cell structure），轉錄（transcription），疾病防御（disease defense），蛋白質合成（protein synthesis），轉運（transporters），信號轉導（signal transduction），新陳代謝及次生代謝（metabolism and secondary metabolism）。從表2中可以看出，與疾病防御相關的cDNA數量最多，共有44條，占功能注釋cDNA序列的25.1%，其中尤以熱激蛋白為多。在此類cDNA序列（表3）中，主要包括溫度誘導載脂蛋白（temperature-induced lipocalin,TIL），過氧化物酶（peroxidase）、銅/鋅過氧化物歧化酶（copper/zinc superoxide dismutase）和熱激蛋白（heat-shock protein）等非生物脅迫相關蛋白，也包括一些病程相關蛋白。細胞色素（cytochrome）是生物體內的一類重要的多功能血紅素氧化還原酶類，在生物防御外界不良環境影響方面起重要作用。另外還有谷胱甘肽轉移酶（glutathione transferase），金屬硫蛋白（metallothionein protein）和泛素蛋白（ubiquitin-protein）等，它們在植物抗病防御中也起著重要作用。在與能量代謝蛋白相關的cDNA序列中發現了14個與脂肪酸代謝相關的基因序列（表4），主要有硬脂酰基ACP去飽和酶（stearoyl-ACP desaturase），長鏈脂肪酸 CoA連接酶（long-chain-fatty-acid CoA ligase），乙酰-CoA羧化酶羧基轉移酶β亞基蛋白（acetyl-CoA carboxylase carboxyltransferase beta subunit protein）， 蘋 果 酸 酯 合 成 酶（malate synthase），蘋果酸酯脫氫酶（malate dehydrogenase）和2-磷酸甘油酸酯脫水酶（2-phosphoglycerate dehydratase）等，其中12個為全長cDNA序列；另外還發現5條油體蛋白（oleosin），油體蛋白主要在植物種子中特異表達，覆蓋于油體表面，在油體發生到分解消失過程中及對維持油體的穩定起著重要的生物學作用［19－20］。

表1 山核桃脂肪代謝期部分cDNA序列的基因本體論分類結果Table 1 GO-based classification of unigenes from sequenced cDNAs of an oil metabolism-related library in Carya cathayensis

表2 基于擬南芥基因功能的cDNA序列分類Table 2 Classification of cDNA sequences based on gene functions in Arabidopsis thaliana

表3 與疾病防御相關的cDNA序列（部分）Table 3 Disease defense-related cDNA sequences in the nut of Carya cathayensis（part）

2.3 GenBank數據庫EST序列的遞交

將有功能注釋的cDNA序列遞交 GenBank數據庫，最終被接受的序列為175條，登錄號為JN786116-JN786290，占全部unigenes的93.1%。

2.4 山核桃cDNA序列的蛋白分析

利用生物信息學的方法獲得了12個與脂肪代謝相關的全長cDNA序列，它們分別編碼硬脂酰基載體去飽和酶蛋白（JN786139），依賴 NADP的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（JN786163），β-酮-ACP合成酶Ⅱ（JN786197），長鏈脂肪酸CoA連接酶（JN786201），線粒體丙酮酸脫氫酶激酶亞型1（JN786205），蘋果酸合成酶（JN786209），乙酰輔酶 A羧化酶 β亞基蛋白羧基（JN786226），磷脂酰乙醇胺結合蛋白（JN786231），脂質結合域（JN786242），海藻糖-6-磷酸合成酶（JN786284），油體蛋白1（JN786177），油體蛋白2（JN786276）。將這些序列翻譯成氨基酸序列，并進行蛋白基本結構分析和保守功能域預測。結果表明，這些蛋白均具有磷酸化位點，可能具有磷酸化和自我磷酸化活性；除油質蛋白外，其他都沒有跨膜區域，且不具信號肽結構，為非分泌蛋白，均屬于某個蛋白家族。油體蛋白中，油體蛋白-1有3個跨膜區，油體蛋白-2有2個跨膜區，且均具有信號肽結構，屬于Oleosin super family蛋白家族。

表4 山核桃中與脂肪代謝相關的cDNA序列Table 4 Fatty acid metabolism-related cDNA sequences in the nut of Carya cathayensis

3 結論與討論

參照基因本體論（gene ontology，GO）和擬南芥基因功能分類等生物信息學分析，有利于對蛋白質功能、代謝通路、相互作用等進行全面、快速、準確地分析。盡管近年來流行使用RNA-seq來分析基因的轉錄表達，雖然能分析相關的代謝途徑及基因表達水平的差異等，但基于方法本身所得的序列都較短，而基于cDNA文庫的測序，因方法上沒有RNA-seq過程將RNA片段化的步驟，因而所得的EST序列往往更長，能夠反映特定時空基因的表達情況，且較容易獲得全長的cDNA序列。

從基于基因本體論分類的分子功能注釋結果來看，建庫時期的種子處于新陳代謝活躍的階段，以參與細胞器部件、細胞部件、細胞過程的cDNA為多，且發現具有催化活性的序列所占比例較高，有酶或酶的結構域存在，說明各種酶活動活躍。事實上，文庫構建所用樣品的時間為8月11－23日［13］。8月11日前，山核桃種子通過細胞分裂，體積逐漸增大至正常大小；8月11日后為種子內部物質轉化期［21－22］，包括脂肪鏈的增長，油脂合成，飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉化等一系列新陳代謝過程。從基于擬南芥基因功能分類來看，細胞抗性與防御部分所占比例最大，其中尤以熱激蛋白為多。熱激蛋白又名脅迫蛋白［20］，高度保守［23－24］，存在于所有生物及所有生物的細胞中，胞外的熱激蛋白可以刺激免疫系統中專門存在抗原的細胞，其功能之一是保護細胞防止其受到脅迫/凋亡［23］；主要的熱激蛋白屬于幾個基因（蛋白）家族［24］。熱激的主要影響之一是使蛋白不能折疊，或不完全折疊，或不合適地折疊［25］，過多地發生依賴于脅迫強度及細胞體系的變化［24］。山核桃果實成熟階段主要在8月，在當地正是高溫的炎炎夏日。熱激蛋白的出現有利于種子抵抗高溫脅迫而進行正常的發育。Hsp70促進蛋白質的折疊過程，在環境脅迫的條件下，蛋白折疊對它的依賴性更強［27］。Hsp90對參與信號轉導的近百個蛋白起調節作用，且與Hsp70等形成基于Hsp70/Hsp90的多蛋白陪伴機制，并通過該機制將參與信號轉導的蛋白與Hsp90組合成復合體［27］。過氧化物酶在植物抵抗病原菌侵染的過程中起著防衛的作用［28］，同時諸如山葵過氧化物酶（horseradish peroxidase）可參與酚類氧化過程，使之形成多聚體及寡聚體，以減少酚類物質在植物體內的毒性。山核桃富含單寧，植物單寧（即植物多酚）為植物體內的復雜酚類次生代謝產物。溫度誘導載脂蛋白（TILs）是植物載脂蛋白中的一類，與非生物脅迫反應相關，在溫度脅迫中起保護光合系統作用［29］，是葉黃素循環中的關鍵酶，在光氧化損害防衛中發揮功能［30］，同時作為耐熱的必要組份，在嚴重熱激誘導的脂類過氧化過程中起著防衛作用［31］。銅/鋅過氧化物歧化酶則催化過氧化氫（H2O2）產生游離的羥基［32］，而過氧化氫的累積是植物在逆境或衰老時體內活性氧代謝加強導致的。這也是為什么山核桃脂肪代謝期防御性EST數量多的原因，這和其果實生物發育期所處的高溫干旱環境脅迫有關。

研究發現13條與山核桃脂肪代謝相關的序列，其中包括乙酰-CoA羧化酶羧基轉移酶β亞基蛋白。乙酰-CoA羧化酶是脂肪酸生物合成過程中的關鍵酶之一，它在生物體內催化形成丙二酰CoA（Malonyl-CoA），而后者是脂肪酸生物合成和脂酰鏈延伸系統等重要代謝反應的底物，被認為是生物體內一個基本的代謝底物和特定蛋白活性的調控代謝物［33］。乙酰-CoA羧化酶活性的過量產生可以增加大腸桿菌中脂肪酸生物合成的速率［34］。這說明研究中構建的山核桃脂肪代謝相關cDNA文庫及本文的研究結果對山核桃油脂脂肪代謝的研究是有幫助的。此外，我們還構建了山核桃脂肪快速增長期（7月15日至8月11日）的cDNA文庫［35］，可以補充本文庫信息的不足。但脂肪快速增長期伴隨著果實的生長，也即果實逐漸增大，內部胚由小變大，液態胚乳逐漸增多，并在胚的發育過程中為胚的生長提供營養，而胚乳本身則逐漸為生長的胚所吸收而消失，整個種殼內逐漸為胚所占據。因此，此期大部分營養物質還是供應果實與種子本身的生長之用。基因表達產物蛋白質分子的各種生物功能與其復雜的結構密切相關。本研究利用生物信息學方法對脂肪代謝相關全長cDNA序列進行了詳細的蛋白分析，蛋白一些性質（如跨膜區結構域、磷酸化位點、二級保守結構域等）的預測會給我們了解該蛋白質的結構域或功能提供一些線索，同時也可為后續蛋白結構與功能、蛋白與核酸的互作、蛋白間的互作分析打下基礎。

［1］ 黃堅欽，鄭炳松，黃有軍，等.木本油料植物山核桃新品種的選育［J］.生物質化學工程，2006（B12）：178-181. HUANG Jianqin,ZHENG Bingsong,HUANG Youjun,et al.Selection and breeding of new varieties of the oil-bearing tree hickory（Carya cathayensis Sarg.）［J］.Biomass Chem Eng,2006（B12）:178-181.

［2］ HATEY F,TOSSER K G,CLOUSCARD-MARTINATO C,et al.Expressed sequenced tags for genes:a review［J］. Gen Selection Evol,1998,30（5）:521-541.

［3］ 駱蒙，賈繼增.植物基因組表達序列標簽（EST）計劃研究進展［J］.生物化學與生物物理進展，2001，28（4）：494-497. LUO Meng,JIA Jizeng.Progress in expressed sequence tags （EST）project of plant genome［J］.Prog Biochem Biophysics,2001,28（4）:494-497.

［4］ 陳全求，詹先進，藍家祥，等.EST分子標記在基因組學中應用的研究進展［J］.中國農學通報，2010，16 （3）：59-63. CHEN Quanqiu,ZHAN Xianjin,LAN Jiaxiang,et al.Study progress on application of EST（expressed sequence tags）in the funcitonal genomics［J］.Chin Agric Sci Bull,2010,16（3）:59-63.

［5］ HATEY F,TOSSER-KLOPP G,CLOUSEARD-MARTINATO C,et al.Expressed sequenced tags for genes:a review ［J］.Genet Sel Evol,1998,30（6）:521-541.

［6］ LANGE B M,WILDUNG M R,STAUBER E J,et al.Probing essential oil biosynthesis and sevretion by functional evaluation of expressed sequence tags from mint glandular trichomes［J］.PNAS,2000,97（6）:2934-2939.

［7］ TRONCOSO-PONCE M A,KILARU A,CAO Xia,et al.Comparative deep transcriptional profiling of four developing oil seeds［J］.Plant J 2011,68（6）:1014-1027.

［8］ WHITE J A,TODD J,NEWMAN T,et al.A new set of Arabidopsis expressed sequence tags from developing seeds. The metabolic pathway from carbohydrates to seed oil［J］.Plant Physiol,2000,124（4）:1582-1594.

［9］ MEKHEDOV S,de ILáRDUYA O M,OHLROGGE J.Toward a functional catalog of the plant genome.A survey of genes for lipid biosynthesis［J］.Plant Physiol,2000,122（2）:389-401.

［10］ BOURGIS F,KILARUC A,CAO Xia,et al.Comparative transcriptome and metabolite analysis of oil palm and date palm mesocarp that differ dramatically in carbon partitioning［J］.PNAS,2011,108（30）:12527-12532.

［11］ 陳英，江香梅，張露，等.基于油茶組59萬條EST序列的轉錄組學初步分析［J］.林業科學，2011，47（2）：161-163. CHEN Ying,JIANG Xiangmei,ZHANG Lu,et al.Transcriptiome characterization for Camellia Sect.Oleifera based on the 592499 ESTs［J］.Sci Silv Sin,2011，47（2）：161-163.

［12］ NATARAJAN P,PARANI M.De novo assembly and transcriptome analysis of five major tissues of Jatropha curcas L. using GS FLX titanium platform of 454 pyrosequencing［J］.BMC Genomics,2011,12（4）:191-202.

［13］ 黃銀芝，周秦，黃有軍，等.山核桃脂肪代謝相關cDNA文庫的構建［J］.浙江農林大學學報，2011，28（1）：80－85．HUANG Yinzhi,ZHOU Qin,HUANG Youjun,et al.Construction of a fat metabolism related cDNA library in Carya cathayensis［J］.J Zhejiang A&F Univ,2011,28（1）:80－85.

［14］ 周秦.山核桃果實成熟期間基因表達的初步分析［D］.臨安：浙江農林大學，2010. ZHOU Qin.Fruit Ripening associated Gene Expression in Carya cathayensis［D］.Lin’an:Zhejiang A&F University,2010.

［15］ NEWMAN T,de BRUIJN F J,GREEN P,et al.Genes galore:a summary of methods for accessing results from largescale partial sequencing of anonymous Arabidopsis cDNA clones［J］.Plant Physiol,1994,106（4）:1241－1255.

［16］ ANDERSON P A,LAWRENCE G J,MORRISH B C,et al.Inactivation of the flax rust resistance gene M associated with loss of a repeated unit within the leucine rich repeat coding region［J］.Plant Cell,1997,9（4）:641－651.

［17］ HOFTE H,DESPREZ T,AMSENLEM J.An inventory of 1152 expressed sequence tags obtained by partial sequencing of cDNA from Arabidopis thaliana［J］.Plant J,1993,4（6）:1051－1061.

［18］ BEVAN M,BANEROFT I,BENT E,et al.Analysis of l.9 Mb of contiguous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana［J］.Nature,1998,391（6666）:453－455.

［19］ HUANG A H C.Oleosins and oil bodies in seeds and other organs［J］.Plant Physiol,1996,110（4）:1055－1061.

［20］ FRANDSEN G I,MUNDY J,TZEN J T C.Oil bodies and their associated proteins,oleosin and caleosin［J］.Physiol Plantarum,2001,112（3）:301－307.

［21］ 黎章矩，高林，王白坡，等．浙江省名特優經濟樹種栽培技術［M］．北京：中國林業出版社，1995.

［22］ 解紅恩，黃有軍，薛霞銘，等．山核桃果實生長發育規律［J］．浙江林學院學報，2008，25（4）：527－531．XIE Hongen,HUANG Youjun,XUE Xiaming,et al.Growth and development of the Carya cathayensis nut［J］.J Zhejiang For Coll,25（4）：527－531．

［23］ LI Z,SRIVASTAVA P.Current Protocols in Immunology［M］.New York:John Wiley and Sons,Inc.,2004.

［24］ SCHLESINGE M J.Heat shock proteins［J］.J Biol Chem,1990,265（21）:12111－12114.

［25］ HIGHTOWER L E.A brief perspective on the heat-shock response and stress proteins［J］.Marine Environ Res［J］, 1993,35（1/2）:IN1-IN2,79－83.

［26］ MAYER M P,BUKAU B.Hsp70 chaperones:cellular functions and molecular mechanism［J］.Cell Molec Life Sci, 2005,62（6）:670－684.

［27］ PRATT W B,TOFT D O.Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery［J］.Exp Biol Med,2003,228（2）:111－133.

［28］ KARTHIKEYAN M,JAYAKUMAR V,RADHIKA K,et al.Induction of resistance in host against the infection of leaf blight pathogen（Alternaria palandui）in onion（Allium cepa var.aggregatum）［J］.Indian J Biochem Biophys, 2005,42（6）:371－377.

［29］ CHARRON J B F,OUELLET F,PELLETIER V,et al.Identication,expression,and evolutionary analyses of plant lipocalins［J］.Plant Physiol,2005,139（4）:2017－2028.

［30］ CHARRON J B F,BRETON G,BADAWI M,et al.Molecular and structural analyses of a novel temperature stressinduced lipocalin from wheat and Arabidopsis［J］.Fed Eur Biochem Soc Lett,2002,517（1/3）:129－132.

［31］ CHI W T,FUNG R W M,LIU H C,et al.Temperature-induced lipocalin is required for basal and acquired thermotolerance in Arabidopsis［J］.Plant Cell Environ,2009,32（7）:917－927.

［32］ YIM M B,CHOCK B,STADTMAN E R.Copper,zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide［J］.Proc Natl Acad Sci,1990,87（13）:5006－5010.

［33］ 石明旺．油茶種子EST文庫構建及油脂合成關鍵酶基因的分離鑒定［D］.長沙：中南林學院，2004．SHI Mingwang.Establishment of ESTs Database from Camellia oleifera A.Seeds and Identification of Key Genes of Oil Synthetase［D］.Changsha:Central South Forestry University,2004.

［34］ DAVIS M S,SOLBIATI J,CRONAN J E Jr.Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli［J］.J Biol Chem,2000,275（37）:28593－28598.

［35］ 黃銀芝.山核桃脂肪代謝相關cDNA文庫的構建及序列分析與利用［D］.臨安：浙江農林大學，2012. HUANG Yinzhi.Construction of a Fat Metabolism-related cDNA Library and Analysis and Utilization of Sequences in Carya cathayensis［D］.Lin’an:Zhejiang A&F University,2012.

Analysis of ESTs associated with oil metabolism in seeds of Carya cathayensis

HUANG Yinzhi1,2，ZENG Yanru1，ZHOU Qin3，XIA Guohua1，HUANG Youjun1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Agricultural Office of Toutuo People’s Government,Huangyan District,Huangyan 318026, Zhejiang,China;3.Jinhua Institute of Agricultural Sciences,Jinhua 321017,Zhejiang,China）

Carya cathayensis is an important oil species with dry nuts that are high oil content,for which there must be some special oil-synthesizing mechanism.In order to explore the mechanism,random cloning and sequencing of cDNAs from a fatty acid metabolism-associated cDNA library,sequence assembly and annotation, Gene Ontology（GO）-and Arabidopsis thaliana-associated MIPS Functional Catalogue（FunCat）-based classification of assembled sequences,and protein analysis of fatty acid metabolism-associated cDNA sequences were performed.A total of 1 010 expressed sequence tags （ESTs）was obtained,based on which 188 unigenes were assembled.There were 92 contigs and 96 singlets among the unigenes,which were classified into categories of cellular component,molecular function,and biological process based on classification of GO and found to overlap one another in functions.But against MIPS Functional Catalogue in Arabidopsis thaliana,these unigenes were classified into nine categories and 143 full-length cDNAs were obtained,from which 14 cDNA sequences were associated with metabolism of fatty acids.It had been found through proteomic analysis that 12 full-lengthfatty acid metabolism-related cDNAs had a phosphorylation site;they were all non-secretory proteins with no transmembrane domain and signal peptide except oleosins,belonging to certain protein family;and oleosins had different transmembrane domains and a signal peptide,belonging to a super oleosin family.［Ch,4 tab.35 ref.］

cash forestry；Carya cathayensis;expressed sequence tag;functional classification;fatty acid metabolism;protein analysis

S722.3；Q753

A

2095-0756（2015）02-0229-08

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（2）：229-236

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.009

2014-06-12；

2014-08-24

浙江省自然科學基金重點項目（Z13C160012）；浙江省科學技術創新團隊項目（2011R50030）；國家高技術研究發展計劃（‘863’計劃）項目（2013AA102605）

黃銀芝，從事經濟林培育與利用研究。E-mail：Huangyinzhi@126.com。通信作者：曾燕如，教授，博士，從事經濟林培育與利用研究。E-mail：yrzeng@zafu.edu.cn