短期干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片抗氧化系統的影響

丁 玲，吳 雪，杜長霞,2，徐艷麗，樊懷福,2

短期干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片抗氧化系統的影響

丁 玲1，吳 雪1，杜長霞1,2，徐艷麗1，樊懷福1,2

（1.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江臨安311300）

以黃瓜‘津優1號’Cucumis sativus‘Jinyou No.1’為試材，采用水培法，通過在營養液中添加不同比例聚乙二醇PEG 6000模擬干旱脅迫，研究短期干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片抗氧化系統的影響。結果顯示：在不同程度干旱脅迫下處理24 h后，超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽還原酶（GR），脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性以及抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH）質量摩爾濃度均下降，其中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶活性、抗壞血酸和還原性谷胱甘肽GSH質量摩爾濃度與對照比較有顯著差異（P＜0.05）；而過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性、可溶性蛋白質量分數和丙二醛（MDA）質量摩爾濃度在脅迫條件下升高，其中可溶性蛋白和丙二醛質量摩爾濃度增加明顯（P＜0.05）；過氧化物酶（POD）活性則呈現出中度脅迫下顯著升高（P＜0.05）和重度脅迫下略有下降的趨勢。以上表明：短期干旱脅迫引起了黃瓜葉片膜脂過氧化加劇，酶促抗氧化系統比非酶促系統在抗氧化過程中起到了更積極的作用。圖3參21

園藝學；黃瓜；干旱脅迫；抗氧化系統

干旱脅迫是世界性的主要自然災害之一，僅次于生物脅迫。在所有非生物危害中占首位，干旱脅迫是限制植物生長發育和產量的重要生態環境因素［1］。全球有1/3以上的土地處于干旱和半干旱狀態。中國華北、西北、內蒙古和青藏高原絕大部分地區屬于干旱和半干旱地區，約占全國土地面積的45%［2］。此外，不均勻降水、季節性的干旱還經常侵襲中國非干旱的主要農業區。如何提高作物的耐旱性或者抗旱性一直是人們研究的熱點［3］，探討干旱脅迫下作物生理機制對于作物抗旱栽培具有重要意義。黃瓜Cucumis sativus是世界性的重要蔬菜作物，也是中國設施栽培的主要蔬菜種類之一，生育期需水量較大且對水分虧缺特別敏感。當土壤相對含水量低于70%時，黃瓜便會生長緩慢，最終導致植株矮小，發育不良，產量降低［4］。植物對干旱脅迫的響應包含極其復雜的生理生化變化，并形成了受遺傳性制約的適應機制［5］。對活性氧（ROS）的響應是植物適應干旱脅迫非常重要的生理生化機制。大量的研究表明：植物在長期的進化過程中形成了酶促和非酶促兩大類保護系統以清除活性氧，減輕或避免活性氧對細胞的傷害，從而表現出對氧化脅迫的抗性［6］。前人對于干旱脅迫的研究主要集中于長時間脅迫后的生理反應，短時間內的生理響應機制尚不清楚，然而植株在短時間脅迫下的逆境應激響應對植物的耐性具有十分重要的意義。因此，本試驗采用水培法，采用聚乙二醇（PEG）6000模擬干旱脅迫，研究了干旱脅迫24 h后對黃瓜幼苗葉片抗氧化系統的影響，以期為黃瓜的抗旱機制研究和抗旱栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試材與處理

以黃瓜品種‘津優1號’‘Jinyou No.1’為材料。種子在培養箱28℃恒溫箱催芽，露白后播種于盛有V（泥炭）∶V（蛭石）=1∶1的50孔穴盤中，置于人工氣候室中育苗，晝溫25℃，夜溫20℃。待幼苗長至2葉1心后，選擇整齊一致、長勢良好的的幼苗洗凈根部移入10 L水培箱中水培。營養液為山崎黃瓜專用配方。用氣泵間歇性通氣（40 min·h－1），待幼苗第3片真葉完全展開時，開始處理。用PEG 6000模擬根際干旱脅迫，設對照（正常營養液栽培，用ck表示）、中度干旱脅迫（含5%PEG 6000的營養液栽培，相當于水勢ψw=－0.05 MPa，用5%表示）、重度干旱脅迫（含10%PEG 6000的營養液栽培，相當于水勢ψw=－0.15 MPa，用10%表示）。處理24 h后取葉片樣品測定相關生理指標。試驗設重復3 次·處理-1。

1.2 測定指標及方法

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照Giannopolitis等［7］的方法。過氧化物酶（POD）活性的測定參照Egley等［8］的方法測定。過氧化氫酶（CAT）活性的測定參照Cakmak&Marschner［9］的方法。抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的活性的測定參照Nakano等［10］的方法。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的活性測定參考Hossain等［11］的方法。谷胱甘肽還原酶（GR）的活性測定參照Foyer等［12］的方法?？箟难幔ˋSA）的質量摩爾濃度測定參照Jiang等［13］的方法。還原型谷胱甘肽（GSH）的測定參照Griffith［14］的方法。丙二醛（MDA）的測定參照Heath等［15］的方法。可溶性蛋白參考Bradford［16］的方法測定。

1.3 數據分析方法

所有數據采用SAS軟件進行單因素方差分析，并對平均數用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片抗氧化系統酶活性的影響

由圖1A可以看出：在干旱脅迫下24 h后超氧化物歧化酶活性顯著下降（P＜0.05），5%和10%PEG 6000處理分別為對照的83.03%和82.09%。過氧化物酶活性在5%PEG 6000脅迫條件下顯著高于對照（P＜0.05），10%PEG 6000脅迫略低于對照但差異不明顯（圖1B）。脅迫條件下過氧化氫酶活性與超氧化物歧化酶活性表現出相反的變化趨勢，5%和10%PEG 6000處理均顯著高于對照（P＜0.05），分別為對照的1.22和1.19倍（圖1C）?？箟难徇^氧化物酶活性在5%PEG 6000處理條件下與對照比較無顯著變化，而在10%PEG 6000處理下顯著高于對照（P＜0.05），較對照提高了21.69%（圖1D）。谷胱甘肽還原酶活性與超氧化物歧化酶活性表現出相似的變化趨勢（圖1E），各處理谷胱甘肽還原酶活性顯著低于對照（P＜0.05），5%和10%PEG 6000等2處理無顯著差異。

如圖1F所示，脫氫抗壞血酸還原酶活性在5%PEG 6000處理條件下變化不明顯，而10%PEG 6000處理下顯著抑制了其活性（P＜0.05），僅為對照的45.01%。單脫氫抗壞血酸還原酶活性在脅迫條件下均下降，其中5%PEG 6000處理下降明顯（P＜0.05），10%PEG 6000與對照無顯著差異。

圖1 干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片抗氧化系統酶活性的影響Figure 1 Effects of drought stress on enzyme activities of antioxidant system in leaves of cucumber seedlings

2.2 干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片抗氧化物質抗壞血酸和還原型谷胱甘肽質量分數的影響

如圖2所示：在干旱脅迫24 h后，幼苗葉片抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH）質量分數均顯著下降（P＜0.05），抗壞血酸和還原型谷胱甘肽質量分數在5%和10%PEG 6000處理條件下分別為對照的74.71%，75.47%和68.74%，68.51%，而5%和10%PEG 6000等2處理無顯著差異。

圖2 干旱脅迫對黃瓜幼苗ASA和GSH質量分數的影響Figure 2 Effects of drought stress on ASA and GSH content in leaves of cucumber seedlings

2.3 干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片可溶性蛋白和丙二醛的影響

由圖3可以看出：干旱脅迫條件下，可溶性蛋白質量分數顯著提高，且隨著脅迫程度的加重增加明顯，10%PEG 6000處理顯著高于5%PEG 6000處理（P＜0.05）（圖3A）。干旱脅迫同樣提高了幼苗葉片的丙二醛質量摩爾濃度，顯著高于對照（P＜0.05），但10%PEG 6000處理與5%PEG 6000處理差異不顯著（圖3B）。

圖3 干旱脅迫對黃瓜幼苗葉片可溶性蛋白和MDA的影響Figure 3 Effects of drought stress on soluble protein and MDA content in leaves of cucumber seedlings

3 討論

當植物遭受干旱、紫外線、高溫及重金屬、病蟲等生物或非生物脅迫時，體內會形成過量的自由基，形成氧化脅迫，導致蛋白質、DNA及脂類的氧化傷害，進而使細胞膜受傷，破壞膜的正常功能［17］。丙二醛是膜脂過氧化作用的產物，不但標志膜脂過氧化程度，也間接反映組織中自由基的含量。丙二醛的產生和積累會加劇對細胞的毒害，使膜的結構和功能受損，還可以使酶分子間發生交聯聚合，導致酶失活［18］。本試驗結果表明：在短期干旱脅迫下，黃瓜幼苗葉片丙二醛質量摩爾濃度增加（P＜0.05），說明活性氧的大量產生對植株造成了過氧化傷害。滲透調節是植物適應干旱等逆境脅迫的重要機制之一。本研究顯示：脅迫條件下黃瓜葉片可溶性蛋白質量分數顯著增加（P＜0.05）?？扇苄缘鞍椎姆e累不僅可以協調細胞與外界滲透壓的平衡，降低細胞的滲透勢，增強從環境吸水的能力，維持水分平衡，還有利于更好地保護膜表面，維持膜的穩定性。因而，可溶性蛋白在植物體內的積累在一定程度上提高了植株的抗性，是植物對外界逆境的重要應激反應。

植物遭受逆境引發活性氧水平升高的同時，也會主動或被動地啟動自身的抗氧化防御系統進行防御，減緩細胞傷害，提高植物對逆境脅迫的適應性。而防御系統中抗氧化酶超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活性的高低就成為控制傷害的關鍵因素［19］。其中，超氧化物歧化酶是植物體內清除活性氧的第一道防線，能催化O2-·生成過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），而生成的過氧化氫（H2O2）則會被過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物酶等抗氧化酶清除，生成氧氣和水。本試驗中，超氧化物歧化酶活性在干旱脅迫條件下顯著下降（P＜0.05），其原因可能是脅迫后迅速抑制了超氧化物歧化酶基因的表達進而導致超氧化物歧化酶合成減少。相反地，過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活性在不同脅迫條件下均上升，而過氧化物酶活性在中度脅迫條件下上升，在重度脅迫條件下下降。酶活性的改變與植物體內的活性氧代謝密切相關，說明在脅迫24 h后，植物體內活性氧代謝的平衡被打破，酶活性不同程度的被誘導或破壞來響應外界環境的改變。

有關抗氧化酶系統與植物耐旱關系的研究已有大量的報道。細胞內活性氧的動態平衡是由抗氧化系統決定的。該系統不僅包括大量的抗氧化酶而且還包括一些抗氧化物質，如抗壞血酸、還原型谷胱甘肽是植物細胞中主要的低分子量可溶性抗氧化劑。這些抗氧化物質在抵御逆境脅迫時同樣重要［20］，也有清除活性氧的作用，它們是抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環系統中的重要物質組分。脫氫抗壞血酸還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、谷胱甘肽還原酶和抗壞血酸過氧化物酶則是植物抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環系統中的關鍵酶組分，在還原型抗壞血酸和還原型谷胱甘肽的再生過程中占有不可或缺的地位。大量的研究資料表明，抗壞血酸和還原型谷胱甘肽的含量及其代謝相關酶類活性的變化是植物對環境脅迫的響應。本試驗發現：在干旱脅迫下抗壞血酸和還原型谷胱甘肽質量摩爾濃度均顯著下降（P＜0.05），這是植物體內活性氧積累導致膜脂過氧化的的重要原因之一。徐向東等［21］研究高溫脅迫黃瓜幼苗抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量也得到了相似的結果。同時，干旱脅迫還導致了谷胱甘肽還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶的酶活性降低，是抗壞血酸和還原型谷胱甘肽質量摩爾濃度降低的重要原因。

然而，植物的抗旱性是一個受多種因素影響的復雜數量性狀，單一的指標難以全面準確地反映抗旱性強弱。綜上所述，在遭受短期中度和重度干旱脅迫后，黃瓜葉片膜系統遭到了破壞，丙二醛質量摩爾濃度顯著增加，酶促抗氧化系統（抗氧化酶活性）較非酶抗氧化系統（抗氧化物質含量）在清除活性氧方面扮演了更重要的角色，但這與脅迫時間密切相關，其精確的機制需要從基因水平、表達調控、信號傳導網絡等多個方面進一步研究。

［1］ CELLIER F,CONéJéRO G,BREITLER J C,et al.Molecular and physiological responses to water deficit in droughttolerant and drought-sensitive sunflower lines （Helianthus annuus L.）:accumulation of dehydrin transcripts correlates with tolerance［J］.Plant Physiol,1998,116（1）:319-328.

［2］ 劉佳,郁繼華,徐秉良,等.干旱氣候條件下水分脅迫對辣椒葉片生理特性的影響［J］.核農學報,2012,26（8）: 1197-1203. LIU Jia,YU Jihua,XU Bingliang,et al.Effects of water stress on the physiological characteristics of pepper leaves in arid climates［J］.J Nucl Agric Sci,2012,26（8）:1197-1203.

［3］ MEDICI L O,REINERT F,CARVALHO D F,et al.What about keeping plants well watered?［J］.Environ Exp Bot, 2014,99（10）:38-42.

［4］ 翟勝,梁銀麗,王巨媛,等.干旱半干旱地區日光溫室黃瓜水分生產函數的研究［J］.農業工程學報,2005,21 （4）:136-139. ZHAI Sheng,LIANG Yinli,WANG Juyuan,et al.Water production function of cucumber in Chinese solar greenhouse in arid and semiarid region［J］.Trans Chin Soc Agric Eng,2005,21（4）:136-139.

［5］ 張智猛,戴良香,宋文武,等.干旱脅迫處理對花生品種葉片保護酶活性和滲透物質含量的影響［J］.作物學報, 2013,39（1）:133-141. ZHANG Zhimeng,DAI Liangxiang,SONG Wenwu,et al.Effect of drought stress at different growth stages on peanut leaf protective enzyme activities and osmoregulation substances content［J］.Agron Sin,2013,39（1）:133-141.

［6］ SAIRAM R K,VASANTHAN B,ARORA A.Calcium regulates Gladiolus flower senescence by influencing antioxidative enzymes activity［J］.Acta Physiol Plant,2011,33（5）:1897-1904.

［7］ GIANNOPOLOLITIS C N,RIES S K.Superoxide dismutase（Ⅰ）occurrence in higher plants［J］.Plant Physiol,1977, 59（2）:309-314.

［8］ EGLEY G H,PAUL R N Jr,VAUGHN K C,et al.Role of peroxidase in the development of water impermeable seed coats in Sida spinosa L.［J］.Planta,1983,157（3）:224-232.

［9］ CAKMAK I,MARSCHNER H.Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase,ascrobate peroxidase,and glutathione reductase in bean leaves［J］.Plant Physiol,1992,98（4）:1222-1227.

［10］ NAKANO Y,ASADA K.Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts［J］. Plant Cell Physiol,1981,22（5）:867-880.

［11］ ANWAR H M,YOSHIYUKI N,KOZI A.Monodehydroascorbate reductase in spinach chloroplasts and its participation in the regeneration of ascorbate for scavenging hydrogen peroxide［J］.Plant Cell Physiol,1984,25（3）:385-395.

［12］ FOYER C H,HALLIWELL B.The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts:a proposed role in ascorbic acid metabolism［J］.Planta,1976,133（1）:21-25.

［13］ JIANG Mingyi,ZHANG Jianhua.Effect of abscisic acid on active oxygen species,antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings［J］.Plant Cell Physiol,2001,42（11）:1265-1273.

［14］ GRIFFITH O W.Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine［J］.Anal Biochem,1980,106（1）:207-212.

［15］ HEATH R L,PACKER L.Photoperoxidation in isolated chloroplasts（Ⅰ）Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation［J］.Arch Biochem Biophysil,1968,125（1）:189－198.

［16］ BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem,1976,72（1/2）:248－254.

［17］ 趙潔,杜潤峰,王龍飛,等.達烏里胡枝子抗氧化防御系統對干旱及增強UV-B輻射的動態效應［J］.草地學報, 2013,21（2）:308－315. ZHAO Jie,DU Runfeng,WANG Longfei,et al.Dynamic responses of antioxidative defense system of Lespedeza davurica to drought and enhanced UV-B radiation［J］.Acta Agrestia Sin,2013,21（2）:308－315.

［18］ 劉忠霞,劉建朝,胡景江.干旱脅迫對蘋果樹苗活性氧代謝及滲透調節的影響［J］.西北林學院學報,2013,28 （2）:15－19. LIU Zhongxia,LIU Jianchao,HU Jingjiang.Effects of drought stress on active oxygen metabolism and contents of adjustment substances in the leaves of apple seedling［J］.J Northwest For Univ,2013,28（2）:15－19.

［19］ JIANG Yiwei,HUANG Bingru.Drought and heat stress injury to two cool-season turfgrasses in relation to antioxidant metabolism and lipid peroxidation［J］.Crop Sci,2001,41（2）:436－442.

［20］ SHARMA P,DUBEY R S.Drought induces oxidative stress and enhances the activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings［J］.Plant Growth Regul,2005,46（3）:209－221.

［21］ 徐向東,孫艷,郭曉芹,等.褪黑素對高溫脅迫下黃瓜幼苗抗壞血酸代謝系統的影響［J］.應用生態學報,2010, 21（10）:2580－2586. XU Xiangdong,SUN Yan,GUO Xiaoqin,et al.Effects of exogenous melatonin on ascorbate metabolism system in cucumber seedlings under high temperature stress［J］.Chin J Appl Ecol,2010,21（10）:2580－2586.

An antioxidant system in cucumber seedling leaves with short term drought stress

DING Ling1,WU Xue1,DU Changxia1,2,XU Yanli1,FAN Huaifu1,2
（1.School of Agriculture and Food Science,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To determine the effect of short term drought stress on an antioxidant system in cucumber seedling leaves,the Cucumis sativus‘Jinyou No.1’seedlings were cultured in a shanqi nutrient solution under drought stress simulated by 5%and 10%PEG 6000.A control,5%and 10%PEG 6000 with three replications was used to compare superoxide dismutase （SOD）,glutathione reductase （GR）,ascorbate （ASA）,glutathione （GSH）,soluble protein,malondialdehyde（MDA）.Results after 24 h of treatment showed that compared to the control,SOD and GR activities as well as ASA and GSH content significantly decreased （P＜0.05）.However, soluble protein and MDA content significantly increased （P＜0.05）.Thus,short term stress resulted in acceleration of the membrane lipid peroxidation,and the enzymatic antioxidant system played a more active role in the process of antioxidant.［Ch,3 fig.21 ref.］

horticulture;cucumber;drought stress;antioxidant system

S642.2

A

2095-0756（2015）07-0285-06

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（2）：285-290

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.017

2014-04-25；

2014-07-02

國家自然科學基金資助項目（31101539，31201658）

丁玲，從事蔬菜栽培生理研究。E-mail:ling_3389@126.com。通信作者：樊懷福，副教授，博士，從事設施園藝與無土栽培研究。E-mail:wwghff@126.com