褐飛虱類酵母共生菌菌體蛋白質提取方法的比較

張海強,陳建明,張玨鋒

褐飛虱類酵母共生菌菌體蛋白質提取方法的比較

張海強1,2,陳建明2,張玨鋒2

（1.杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036；2.浙江省植物有害生物防控重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州310021）

為了篩選出適合褐飛虱Nilaparvata lugens類酵母共生菌蛋白質提取的細胞破碎方法，選擇超聲波破碎法、反復凍融法和液氮研磨法等3種細胞破碎方法提取共生菌吡蟲啉敏感菌株和抗性菌株蛋白質。結果表明：菌體顯微形態觀察發現，使用超聲波破碎法和液氮研磨法處理類酵母共生菌的細胞破碎效果均優于反復凍融法，處理后菌體分布均勻，破碎徹底；72 h是提取菌體蛋白質的最佳培養時間。定量分析表明：用超聲波破碎法提取蛋白質質量濃度最高，液氮研磨法次之，反復凍融法提取蛋白質質量濃度的效果最差，各方法所提蛋白質質量濃度差異顯著（P＜0.05）。培養72 h后，超聲波破碎法、液氮研磨法和反復凍融法提取的蛋白質質量濃度分別為2.82 g·L－1，2.62 g·L－1和2.12 g·L－1（敏感菌株）及2.64 g·L－1，2.53 g·L－1和2.05 g·L－1（抗性菌株）。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析發現：超聲波破碎法獲得的蛋白質不僅得率高，且條帶清晰，豐度好。液氮研磨法雖得率高，但蛋白質部分降解，條帶不清晰；而反復凍融法獲得的蛋白質得率最低。超聲波破碎法更適合于褐飛虱類酵母共生菌的蛋白質提取，該研究為后續蛋白質的雙向電泳實驗和分離差異蛋白質提供技術支撐。圖4表1參22

植物保護學；褐飛虱；類酵母共生菌；菌體蛋白質；提取方法

褐飛虱Nilaparvata lugens是中國水稻Oryza sativa的最重要害蟲之一。藥劑防治仍是控制該蟲的主要手段。由于長期濫用吡蟲啉等農藥使褐飛虱產生抗藥性，造成褐飛虱再猖獗，也帶來稻谷的農藥殘留［1］。研究褐飛虱抗藥性產生機制，探索褐飛虱抗藥性的延緩治理途徑是中國水稻生產中亟待解決的重要課題。研究發現：褐飛虱對吡蟲啉的抗性機制與酯酶（羧酸酯酶）、谷胱甘肽-S-轉移酶和細胞色素P450單加氧酶等解毒酶的解毒作用增強、乙酰膽堿受體敏感性下降等有關［2－3］。目前，褐飛虱對吡蟲啉產生抗藥性，特別是其快速產生高水平抗藥性的分子機制仍不很清楚。褐飛虱腹部脂肪體內存在著大量的類酵母共生菌（yeast-like symbiotes，簡稱YLS），這些共生菌在褐飛虱生長發育、繁殖和致害性變異過程中起著重要作用［4－9］。褐飛虱類酵母共生菌—解脂假絲酵母Candida lipolytica體內羧酸酯酶、多功能氧化酶、尿酸酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等活性的提高與其抗吡蟲啉水平有關［10－11］，抗吡蟲啉類酵母共生菌對吡蟲啉農藥有一定降解能力，敏感種群的共生菌則無降解作用［12］。這些結果表明：褐飛虱體內類酵母共生菌在褐飛虱對吡蟲啉抗性發展中可能起重要作用，但目前尚未分離鑒定到共生菌中與殺蟲劑解毒/降解相關的基因，因此，共生菌在褐飛虱對吡蟲啉產生抗藥性中的分子機制尚不清楚。蛋白質組學（proteomics）和生物信息學（bioinformatics）技術的迅速發展為研究類酵母共生菌在褐飛虱抗藥性產生中的分子機制提供了契機。蛋白質組學技術為揭示褐飛虱類酵母共生菌中殺蟲劑解毒/降解相關的生理變化提供了有效手段。在酵母類真菌蛋白質組學研究中，獲取相關胞內蛋白質是首要問題。酵母類真菌細胞表面厚厚的細胞壁限制了其胞內蛋白質的提取。破碎真菌細胞的方法主要有超聲波法、液氮研磨法、玻璃珠法［13］、玻璃棒研磨法［14］等或者幾種方法結合使用的方法。本研究采用超聲波破碎、反復凍融和液氮研磨等細胞破碎方法，比較提取褐飛虱類酵母共生菌不同抗感菌株菌體蛋白質質量濃度與純度，選擇出適合褐飛虱類酵母共生菌菌體蛋白質的提取方法，為后續蛋白質的雙向電泳實驗和分離差異蛋白質提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 敏感菌株：褐飛虱類酵母共生菌——解脂假絲酵母來源于浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所從褐飛虱體內分離純化的菌株。該菌株沒有接觸過任何農藥。抗性菌株：敏感菌株在含2 000 mg·L－1吡蟲啉培養基中連續培養20代獲得的菌株。

1.1.2 培養基 采用綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂（CPDA）液體培養基。配方組成（g·L－1）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株種子液的培養 取活化后的斜面菌株1環，接入50 mL液體培養基中，28℃，180 r·min－1培養24 h，備用。

1.2.2 菌株培養和菌體收集 實驗設置12，24，36，48，60，72，96，120 h共8個時間段，取相應數量250 mL錐形瓶標記好，加入液體培養基100 mL·錐形瓶－1。分別取抗性菌株和敏感菌株種子菌液0.1 mL接種到對應的液體培養基中，重復3次。28℃，180 r·min－1黑暗培養，取相應時間段的培養液，3 000 r·min－1，4℃，離心10 min，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2～3次，用離心管收集菌體，4℃冰箱保存。

1.2.3 菌體蛋白質提取 ①超聲波破碎法。在裝有0.5 g濕菌體的離心管中加入5 mL提取液［主要成分：0.1 mol·L－1pH 7.5三羥甲基氨基甲烷（Tris-Cl），0.2 mol·L－1氯化鈉，0.005 mol·L－1二硫蘇糖醇（DTT），體積分數20%的甘油，5 mmol·L－1乙二胺四乙酸（EDTA），1 mmol·L－1苯甲基磺酰氟（PMSF）］，混勻菌體，充分振蕩后于冰上靜置2～3 min，400 W，15 min超聲波破碎菌體，破碎要在冰上進行，使菌體保持4℃以下的低溫，重復破碎1次。然后4℃，12 000 r·min－1離心40 min，吸出上清液，轉移到新的離心管中。向離心管中加入5倍體積的沉淀液 （醋酸銨甲醇溶液）沉淀蛋白。將沉淀下來的蛋白團塊4℃，6 000 r·min－1離心20 min，去上清；加入5 mL甲醇溶液反復吹打洗滌蛋白，6 000 r·min－1離心20 min，去上清；重復操作1次。再加入5 mL丙酮溶液反復吹打洗滌蛋白，6 000 r·min－1離心20 min，去上清；重復操作1次。將洗干凈的蛋白質分裝成5管，晾干后－80℃保存備用。②反復凍融法。在裝有0.5 g濕菌體的離心管中加入5 mL提取液，混勻菌體，充分振蕩后于冰上靜置2～3 min，將離心管置于－70℃冰箱凍存30 min后取出置于20℃水浴鍋溶解5～10 min（至溶解），重復操作3次。然后4℃，12 000 r·min－1離心40 min，吸出上清液，轉移到新的離心管中。向離心管中加入5倍體積的沉淀液（醋酸銨甲醇溶液）沉淀蛋白。再按照①超聲波破碎提取法中的沉淀蛋白的去上清、洗滌等步驟重復3次，最后將洗干凈的蛋白質分裝成5管，晾干后－80℃保存備用。③液氮研磨法。將收集到的0.5 g濕菌體移入滅菌的研缽中，加入液氮研磨，直至菌體成均勻粉末狀后，加入5 mL提取液，充分振蕩混勻后于冰上靜置2～3 min，重復操作3次。然后4℃，12 000 r·min－1離心40 min，吸出上清液，轉移到新的離心管中。向離心管中加入5倍體積的沉淀液（醋酸銨甲醇溶液）沉淀蛋白。再按照①超聲波破碎提取法中的沉淀蛋白的去上清、洗滌等步驟重復3次，最后將洗干凈的蛋白質分裝成5管，晾干后在－80℃冰箱中保存備用。

1.2.4 不同破碎方法處理后菌體形態觀察 取1片潔凈載玻片，用接種環沾無菌水于載玻片上，蘸取少許不同方法處理的類酵母共生菌液于載玻片的水滴上，涂片，熱固定后，加1滴結晶紫溶液，并用蓋玻片覆蓋，1～2 min后水洗（水不得直接沖洗涂菌處），用吸水紙吸干，待制片干燥后，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 蛋白質質量濃度測定 利用Bradford的考馬斯亮藍G-250染色法測定。取上述提取的上清液0.2 mL，加考馬斯亮藍溶液1 mL，靜置2 min后，在595 nm下測吸光度D（595）值。從蛋白質標準曲線（圖1）上查出樣品對應的蛋白質質量濃度。

1.2.6 蛋白質純度比較 利用SDS-PAGE電泳分離培養72 h后的共生菌蛋白質樣品。制備150.00 g·L-1的濃縮膠和40.00 g·L-1的分離膠，加入蛋白質樣品進行電泳。電泳過程保持在穩流的條件下，濃縮膠時電壓為80 V，分離膠時為120 V，待溴酚藍到達凝膠底部邊緣時結束試驗。電泳結束后，使用考馬斯亮藍染液37℃搖床染色2 h。對凝膠圖像進行掃描，利用凝膠成像系統的蛋白質分析軟件，觀察不同提取方法獲得蛋白質的條帶差異。

1.3 數據分析

采用Excel軟件進行數據統計并作圖，利用數據處理系統SPSS 17.0軟件對相關數據進行統計和方差分析。

圖1 蛋白質標準曲線Figure 1 Standard curve of protein

2 結果與分析

2.1 不同破碎方法處理后褐飛虱類酵母共生菌顯微形態比較

圖2和圖3中顯示的是培養72 h后3種細胞破碎方法對褐飛虱類酵母共生菌的處理效果。可以看到：無論敏感菌株還是抗性菌株，未經處理的褐飛虱類酵母共生菌呈鏈狀排列。超聲波破碎法處理過的菌體呈分散狀態，破碎很徹底；液氮研磨法處理過的菌體破碎均勻，其破碎程度與超聲波處理無明顯差異；而反復凍融法處理后，可以明顯看到有大部分菌體未破碎，其破碎程度明顯低于前2種方法。該結果說明:超聲波破碎法與液氮研磨法處理后共生菌菌體呈分散狀，破碎程度明顯高于反復凍融法。

圖2 不同方法處理褐飛虱類酵母共生菌敏感菌株的顯微形態比較（光鏡40×）Figure 2 Microscopic morphology of susceptible strain of yeast-like symbiote in Nilaparvata lugens treated by different extraction methods （light microscopy 40×）

進一步從敏感菌株和抗性菌株的不同破碎處理后菌體顯微形態中看出：敏感菌株用上述3種方法處理的破碎程度分別高于抗性菌株的結果。

2.2 不同培養時間提取的蛋白質質量濃度變化

表1數據顯示：隨著培養時間的增加，3種方法提取的蛋白質質量濃度也增加。培養72 h后3種方法處理抗性菌株和敏感菌株所得蛋白質質量濃度均達到最高，而后趨于平穩，說明72 h是提取菌體蛋白質的最佳培養時間。對敏感菌株的提取方法中，超聲波破碎法提取的蛋白質質量濃度顯著（P＜0.05）大于液氮研磨法和極顯著（P＜0.01）大于反復凍融法，液氮研磨法也顯著（P＜0.05）高于反復凍融法；培養72 h后，超聲波破碎法、液氮研磨法和反復凍融法提取的蛋白質質量濃度分別為2.82 g·L－1，2.62 g· L－1和2.12 g·L－1。對抗性菌株的提取方法中，同樣是超聲波破碎法提取的蛋白質質量濃度顯著（P＜0.05）大于液氮研磨法和極顯著（P＜0.01）大于反復凍融法，液氮研磨法又顯著（P＜0.05）高于反復凍融法；培養72 h后，超聲波破碎法、液氮研磨法和反復凍融法提取的蛋白質質量濃度分別為2.64 g·L－1，2.53 g· L－1和2.05 g·L－1。這說明無論抗性菌株還是敏感菌株用超聲破碎法提取的蛋白質質量濃度較高。

進一步比較敏感菌株和抗性菌株的蛋白質質量濃度差異時發現，敏感菌株的3種提取方法提取的蛋白質質量濃度分別高于抗性菌株的結果。

表1 不同培養時間下抗感菌株蛋白質質量濃度的方差分析結果Table 1 Results of variance analysis of mycoprotein concentrations of different strains of yeast-like symbiote from Nilaparvata lugens at different culture times

2.3 不同破碎方法提取的蛋白質的SDS-PAGE電泳結果

培養72 h后，用3種方法提取菌體蛋白質，再取等量所提取的蛋白質樣品進一步通過SDS-PAGE電泳（圖4）進行分析。可以看出：無論抗性菌株還是敏感菌株，相同質量的蛋白質中反復凍融法的得率最少，而且提取的蛋白質豐度很低，與超聲破碎法和液氮研磨法的差異明顯；超聲破碎法與液氮研磨法提取的蛋白質質量濃度較高，但是液氮研磨法提取的蛋白質存在一定程度的降解，蛋白質條帶不夠清晰。還發現，超聲波破碎法和反復凍融法提取的敏感菌株的菌體蛋白質條帶數、條帶顏色明顯多（深）于抗性菌株，說明敏感菌株用這2種方法提取的菌體蛋白質種類較多、蛋白質質量濃度較大。但液氮研磨法由于部分蛋白質降解，抗性菌株和敏感菌株之間的蛋白質條帶顏色深，差異不明顯。上述結果說明，對敏感菌株還是抗性菌株，超聲破碎法提取的蛋白質質量濃度高，豐富性好，而且條帶分布均勻，可以作為后續雙向電泳的樣品提取方法。

3 討論

褐飛虱類酵母共生菌與其他真菌類微生物類似，其細胞表面也存在有一層包被，即細胞壁。酵母菌的細胞壁主要有酵母纖維素組成，分為3層：外層是甘露聚糖，中間夾有一層蛋白質分子，內層是葡聚糖。酵母細胞壁有一定的韌性，因此提取酵母細胞蛋白質時破壁就成為瓶頸問題。目前，已報道破碎真菌細胞的方法主要有超聲波破碎法、液氮研磨法、玻璃珠法［13］、玻璃棒研磨法［14］或者幾種方法結合使用的方法等。超聲波破碎法操作簡單，但是工作時會產生熱量，時間掌握不好易引起蛋白降解［15］;液氮冷凍研磨因液氮揮發極快，操作非常困難;玻璃珠破壁是一種比較經典的方法，通常單純用渦旋振蕩，但提取的蛋白質質量濃度偏低，加用玻璃棒研磨后蛋白質質量濃度明顯提高［14］。

采用不同方法提取蛋白質的效果不同［16－17］，酵母菌需裂解以釋放胞內蛋白質，裂解比例越大，釋放的蛋白質越多。許多學者對酵母類真菌微生物蛋白質組學研究中蛋白質的提取方法進行了研究，提出了一些適用于酵母類真菌的蛋白質提取方法。王爽等［18］報道超聲波法與玻璃珠研磨法結合是提取白假絲酵母 Candida albicans和茄病鐮刀菌 Fusarium solani胞內蛋白質的最佳方法。焦立新等［14］為了有效破碎熱帶念珠菌Monilia guilliermondi，季也蒙念珠菌Candida tropicals和光滑念珠菌Candida glabrata菌體的細胞壁，利用玻璃珠渦旋震蕩加玻璃棒研磨法，獲得理想結果。胡彬彬等［19］也認為玻璃珠渦旋、振蕩結合玻璃棒研磨法提取真菌蛋白質效果好，是一種潛在的適合提取大部分真菌總蛋白質的提取方法。于影等［20］認為：超聲波-硫酸銨沉淀法提取東方伊薩酵母Issatchenkia orientalis蛋白質質量濃度明顯高于比單純超聲波和超聲波-丙酮/三羧酸循環（TCA）沉淀法，并獲得分辨率高和重復性好的雙向電泳圖譜。研究發現，超聲波破碎細胞的機制可能與超聲波作用于溶液時氣泡產生、長大和破碎的空氣現象有關，空氣現象引起的沖擊波和剪切力使細胞裂解［21］。

超聲波不同超聲時間提取蛋白質的效果也不同。田曉蓓等［22］報道了超聲時間對革蘭陽性兼性厭氧球菌——變異鏈球菌蛋白質提取的影響，發現隨著超聲時間的延長，提取的蛋白質質量濃度也相應增加，在超聲處理96圈時（總時間16 min），提取的蛋白質質量濃度達到最大；超聲時間繼續延長，蛋白質質量濃度反而下降，說明超聲時間過短蛋白質提取不充分，超聲時間過長會引起蛋白質降解。我們在預備試驗中發現超聲時間15 min，提取的類酵母共生菌菌體蛋白質最多。

有學者認為，同一種提取方法對不同菌株蛋白質的提取效果相似，如焦立新等［14］用玻璃珠渦旋震蕩結合玻璃棒研磨法提取熱帶、季也蒙和光滑3種念珠菌的臨床分離株，獲得的蛋白質質量濃度基本相同。也有學者認為，同一種方法對不同真菌蛋白質的提取效果不一樣，如王爽等［18］報道，在相同超聲波功率和作用時間下對白假絲酵母和茄病鐮刀菌胞內蛋白質的組分和質量濃度有差異，并認為這可能是由于這2種真菌的細胞壁成分存在差異所致。本研究發現：同一種提取方法對吡蟲啉敏感菌株和抗性菌株蛋白質的提取效果也有差異，敏感菌株用超聲波震蕩、液氮冷凍或反復凍融法提取的菌體蛋白質組分、蛋白質質量濃度均多（高）于抗性菌株結果，其原因可能是由于在吡蟲啉的長期脅迫下抗性菌株胞內相關酶種類減少或酶活性失活造成。

本研究表明：無論是敏感菌株還是抗性菌株，超聲波法破碎的類酵母細胞壁徹底，提取的菌體蛋白質質量濃度高、豐富性好、蛋白條帶均勻清晰；液氮研磨法的破碎程度與超聲波無明顯差異，但其提取的蛋白質有一定降解，蛋白條帶也不夠清晰；反復凍融法的破碎程度明顯低于超聲波和液氮法，且提取的蛋白質豐度很低。因此，適用于褐飛虱類酵母共生菌菌體蛋白質提取的最佳方法為超聲波法。該方法操作簡便、破碎時間短、蛋白質性狀穩定、變性少，可以作為后續蛋白質雙向電泳的樣品提取方法。

圖4 用3種方法提取的不同抗性菌株菌體蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜Figure 4 SDS-PAGE pattern of mycoprotein of different resistant yeast-like symbiote strains from Nilaparvata lugens extracted with three methods

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To select the most suitable cell breaking method for protein extraction of the yeast-like symbiote （YLS）isolated from brown planthopper,Nilaparvata lugens,three cell breaking methods:ultrasonication,repeated freeze-thaw,and liquid nitrogen grinding,were used to extract the mycoprotein of susceptible-and resistant-imidacloprid strains of YLS.Analysis was conducted by Duncan’s new multiple range test（DMRT）and sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）.Results of observation using cell microscopic morphology showed that the breaking effect of the YLS cells treated with ultrasonication and liquid nitrogen grinding were greater than repeated freeze-thaw.After treatment,cells were uniformly distributed and thoroughly broken.Optimum culture time for mycoprotein extraction was 72 h.Protein concentration for the three methods was significantly different （fd=8,P＜0.05）with ultrasonication highest,then liquid nitrogen grinding,and lastly repeated freeze-thaw.After being cultured for 72 h,protein concentrations for the susceptible strain were ultrasonication,2.82 g·L－1;liquid nitrogen grinding,2.62 g·L－1;and repeated freeze-thaw,2.12g·L－1;protein concentrations for the resistant strain were ultrasonication,2.64 g·L－1;liquid nitrogen grinding, 2.53 g·L－1;and repeated freeze-thaw,2.05 g·L－1.Electrophoresis showed that proteins extracted by ultrasonication had clear bands,greater abundance,and more protein;by liquid nitrogen grinding had partial protein degradation and unclear bands;and by repeated freeze-thaw had the least protein.Thus,the ultrasonication method was best for mycoprotein extraction of YLS from N.lugens,and in the future this will provide technical support for two dimensional electrophoresis protein experiments and separation of differential proteins.［Ch,4 fig.1 tab.22 ref.］

plant protection;Nilaparvata lugens;yeast-like symbiote;mycoprotein;extraction method

S476

A

2095-0756（2015）02-0173-08

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（2）：173-180

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.002

2014-06-14；

2014-09-15

國家自然科學基金資助項目（30771411，31272040）；浙江省自然科學基金資助項目（LY13C140008）

張海強，從事褐飛虱抗藥性機制研究。E-mail：zhqyuy112@163.com。通信作者：陳建明，研究員，從事水稻害蟲抗藥性監測、抗性機制與抗性治理技術研究。E-mail:chenjm63@163.com

Extraction methods for mycoprotein,a yeast-like symbiote isolated from brown planthopper,Nilaparvata lugens,in rice

ZHANG Haiqiang1,2,CHEN Jianming2,ZHANG Juefeng2

（1.College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,Zhejiang,China;2. State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control,Institute of Plant Protection and Microbiology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,Zhejiang,China）