酶聯(lián)免疫斑點試驗法在青春期少兒活動性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用*

西安市中心醫(yī)院(西安710003)

孫 艷 杜方雄△

·臨床檢驗·

酶聯(lián)免疫斑點試驗法在青春期少兒活動性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用*

西安市中心醫(yī)院(西安710003)

孫 艷 杜方雄△

目的:評價酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)在青春期少兒活動性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值。方法：收集青春期活動性結(jié)核病患者52例，進行ELISPOT檢測，并與病理檢測、結(jié)核PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查結(jié)果相對比。結(jié)果：結(jié)核病患者中ELISPOT敏感性94.9 %，而病理診斷、PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查的陽性率分別為61.1%、12.1%、19.1%、12.0%，顯著高于其它輔助檢查方法。結(jié)論：ELISPOT檢查靈敏、快速，適宜作為青春期少兒結(jié)核病診斷的重要輔助工具。

近年來一種新型的診斷技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)在成人結(jié)核病診斷中的作用得到了人們的認可。但該方法在青春期少兒結(jié)核病感染中的診斷作用如何少見報道。本研究對青春期結(jié)核病少兒做了ELISPOT檢測，并與臨常用的其他結(jié)核病的輔助檢查進行比較，探討了該方法在青春期少兒結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值。

對象和方法

1 研究對象 選取西安交通大學第一附屬醫(yī)院2013年1月至2014年12月收治的9～18歲青春期活動性結(jié)核病患者52例，診斷標準參考《諸福堂實用兒科學》第7版。女11例，男41例，平均年齡16.7 歲;最終診斷肺結(jié)核7例，結(jié)核性胸膜炎18例，結(jié)核性腹膜炎、結(jié)核性腦膜炎、腸結(jié)核及腎結(jié)核合并膀胱結(jié)核各1例。

2 試驗方法 患者入院后行病理檢測、結(jié)核聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、痰涂片抗酸染色、結(jié)核抗體檢查及ELISPOT檢測。ELISPOT檢測使用TSPOT-TB(英國Oxford Immunotec Let)試劑盒。

ELISPOT操作方法：①采集患者外周靜脈血3～4ml，肝素抗凝，于6h內(nèi)進行試驗 ②Ficoll液分離外周血單個核細胞，用培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為2.5×105個/ml，加入預(yù)包被INF-γ抗體的96孔微孔板里，每份4個孔; ③加入抗原:分別加入植物血凝素PHA、 抗原A(ESAT-6)、抗原B(CFP-10)、細胞培養(yǎng)液，分別作為陽性對照陰性、兩種實驗抗原及陰性對照。 ④溫箱培養(yǎng) 24 h; ⑤PBS洗板4次，加入生物素標記的二抗;⑥加入親合素標記的酶結(jié)合物,使底物顯色,在細胞因子分泌的地方形成斑點; ⑦結(jié)果判斷:用計算機輔助成像分析系統(tǒng)進行斑點閱讀與統(tǒng)計。陽性對照孔如出現(xiàn)斑點，說明試驗成功。當測試孔A或B達到以下標準則判定為陽性結(jié)果：① 如果陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個，測試孔斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)≥6。② 如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6個，測試孔斑點數(shù)必須≥2倍的陰性對照孔斑點數(shù)。

3 統(tǒng)計學方法 用SPSS17．0統(tǒng)計學軟件，多組之間率的比較進行卡方檢驗，配對資料進行配對卡方檢驗，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 ELISPOT試驗在結(jié)核病診斷中的敏感性評價 結(jié)核病患者中，ELISPOT方法檢測的陽性率為94.9%，而病理診斷、PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查的陽性率分別為61.1%、12.1%、19.1%、12.0%，ELISPOT陽性率顯著高于其它輔助檢查(P<0.05)，見表1。部分PCR的檢測用血標本檢測為陰性，而在肺泡灌洗液中檢測為陽性；其中1例肺結(jié)核患者及1例腎結(jié)核合并膀胱結(jié)核患者ELISPOT試驗為陰性。

表1 ELISPOT與其它各種方法檢查陽性率比較

2 ELISPOT與結(jié)核PCR試驗的一致率和敏感度 在25例活動性青春期結(jié)核病患者中，同時做了ELISPOT與PCR試驗，該兩種方法的一致率為12%，其中20例患者PCR方法檢測陰性，但ELISPOT試驗檢測陽性，ELISPOT敏感率為92%，PCR敏感率為12%，經(jīng)配對卡方檢驗，二者有統(tǒng)計學差異，見表2。

3 ELISPOT與TB-IgG試驗的一致率和敏感度 23例結(jié)核患者同時做了ELISPOT與TB-IgG的檢測，其中ELISPOT試驗的敏感性明顯高于TB-IgG，見表3 。

表2 結(jié)核病少兒的PCR和ELISPOT試驗的一致率和敏感度

表3 結(jié)核病少兒PCR和ELISPOT試驗一致率和敏感度

討 論

目前青春期少兒結(jié)核病的診斷主要依靠病史、PPD、影像學檢查、涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核抗體和抗原檢測、分子生物學診斷，其中病原學檢查是結(jié)核病診斷的金標準，但敏感性太低。

ELISPOT檢測是一種新型的快速檢測結(jié)核感染的方法。其原理為將結(jié)核桿菌所特有的兩種抗原ESAT26和CFP10加入受檢者的外周血單個核細胞中進行孵化，若該機體感染了結(jié)核分枝桿菌，則可刺激其中的記憶性T細胞增殖分化，釋放IFN-γ，計數(shù)這些細胞來判別機體是否感染結(jié)核。據(jù)報道該方法的敏感度及特異度都很高[1]。但該方法在青春期少兒結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用價值如何，少見報道。本試驗比較了青春期結(jié)核病患者的ELISPOT試驗、痰涂片結(jié)核菌查找、病理檢測、結(jié)核抗體及結(jié)核PCR的方法。在本研究中，ELISPOT在青春期少兒結(jié)核病中的陽性率達94.9%，與其它研究結(jié)果相似[2]。其敏感性顯著高于細菌學檢查陽性率(19%)及PCR(12%)、IgG(12%)。有實驗用雙核酸實時熒光 PCR 技術(shù)檢測結(jié)核桿菌，陽性率(41.4%)高于本試驗組[3]，但其水平仍低于ELISPOT方法。本試驗中病理學檢查陽性率高達61.1%，但因病理學檢查受其標本取材的限制，不能廣泛開展。在本研究中有2例ELISPOT試驗陰性，因此ELISPOT方法還需結(jié)合其它臨床資料綜合分析做出臨床診斷。在以后的研究中，隨著樣本量擴大后將能看到更多的假陰性結(jié)果，需進一步分析影響ELISLPOT方法的原因。

有研究表明在結(jié)核性胸膜炎的診斷中用胸腔積液檢測ELISPOT的陽性率要高于用外周血的[4]。與此相似的是本試驗中部分PCR的檢測用血標本檢測為陰性，而在肺泡灌洗液中檢測為陽性，故為提高結(jié)核病診斷，需多次、多部位采取標本，尤其是感染部位的PCR更可靠。

可見，ELISPOT方法診斷青春期少兒結(jié)核感染敏感度高于痰涂片檢查、病理檢測、結(jié)核抗體及PCR的方法，可作為這些患者有價值的輔助診斷依據(jù)。與其它傳統(tǒng)診斷方法相結(jié)合，可望提高診斷的準確性。

[1] Kim CH, Kim JY, Hwang YI,etal. Interferon-γ enzyme-linked immunospot assay in patients with tuberculosis and healthy adult [J]. Tuberc Respir Dis,2014, 76: 23-29.

[2] Higuchi K, Kawabe Y, Mitarai S,etal. Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection [J]. Medical Microbiology and Immunology, 2009, 198: 33-37.

[3] 劉尚武，梁亞萍，朱 蕾,等.雙核酸實時熒光 PCR 技術(shù)在分枝桿菌檢測中的臨床應(yīng)用[J]. 陜西醫(yī)學雜志, 2014，43(8): 1096-97.

[4] Liao M, Yang Q, Zhang J,etal. Clin Vaccine Immunol. Gamma interferon immunospot assay of pleural effusion mononuclear cells for diagnosis of tuberculous pleurisy[J]. 2014, 21(3):347-53.

(收稿：2015-03-10)

*陜西省自然科學基金項目(2012JM4049)

酶聯(lián)免疫斑點檢測 結(jié)核/診斷 結(jié)核菌素試驗 青少年

R52

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.067

△通訊作者