HIF-2α在宮頸癌組織中的表達及意義

陜西省腫瘤醫院婦瘤科(西安710061)

袁 淵 常曉斌△ 姚安梅 周 敏

HIF-2α在宮頸癌組織中的表達及意義

陜西省腫瘤醫院婦瘤科(西安710061)

袁 淵 常曉斌△姚安梅 周 敏

目的：探討低氧誘導因子2α(HIF-2α)在宮頸癌組織中的表達以及在宮頸癌發生發展中的作用。方法：采用免疫組化法檢測HIF-2α在正常宮頸及宮頸癌組織中的表達，并將HIF-2α表達與宮頸癌的臨床病理特征進行相關分析；采用siRNA技術干擾HIF-2α在宮頸癌細胞HeLa、SiHa的表達，Western blot技術檢測HIF-2α蛋白在宮頸癌細胞的表達； MTT試驗檢測HeLa、SiHa細胞增殖情況。結果：HIF-2α在宮頸癌組織的表達明顯高于正常宮頸組織，經χ2檢驗，有統計學意義，并且HIF-2α表達與宮頸癌的淋巴轉移呈正相關，但與宮頸癌患者的年齡、病理分級以及臨床分期無顯著性相關。低氧可誘導HIF-2α表達增加，并促進HeLa、SiHa細胞增殖，而干擾HIF-2α表達后，則抑制HeLa、SiHa細胞增殖，經t檢驗，具有統計學意義。結論：HIF-2α在宮頸癌中的表達升高，其對宮頸癌的發生發展起促進作用。

目前宮頸癌的發病率在全球婦女惡性腫瘤中位居第三，也是導致女性死亡的第四大惡性腫瘤[1]。雖然在宮頸癌的臨床診治方面取得了一些進展，但關于宮頸癌發病的具體機制尚未闡明。HIF-2α(Hypoxia-inducible factor-2α)是一種低氧轉錄反應的調節子，其主要表達在血管內皮細胞中，與胚胎的形成及發育密切相關[2]。近年來，有研究報道HIF-2α在許多類型腫瘤中的表達上調，例如乳腺癌、結腸癌、前列腺癌等[3]，并有可能是腫瘤干細胞的一種標志[4]。為了闡明HIF-2α蛋白在宮頸癌中的表達及作用，本研究應用免疫組化技術檢測HIF-2α蛋白在宮頸癌中的表達情況，并通過siRNA干擾及Western blot等技術深入探討HIF-2α蛋白在宮頸癌發生、發展中的作用。

材料和方法

1 材 料 90例臨床標本來自于陜西省腫瘤醫院2011年12月至2013年12月婦瘤科住院患者，其中宮頸癌組織63例，患者術前均未進行放療及化療，正常宮頸組織27例，取自于同時期住院的子宮肌瘤子宮全切患者，所取組織立即置于10%中性福爾馬林固定。所有標本均經查閱病例資料并由本院病理醫師復閱HE切片證實。

2 主要試劑與儀器 siRNA片段由北京英俊公司合成；HeLa、SiHa細胞株購自ATCC(美國組織培養保藏中心)；HIF-2α蛋白抗體(Abcam, 美國)；β-actin單抗(Santa Cruz，美國)；脂質體Lipofectamine2000TM(Invitrogen，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國)；DMEM培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；CoCl2(Sigma, 美國)；CO2培養箱(Thermo，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；酶標儀(Bio-Rad，美國)；顯微鏡(Olympus，日本)。

3 實驗方法

3.1 細胞培養： He La、SiHa細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中，置5% CO2培養箱中，37oC孵育。低氧環境采用含300 μmol/L氯化鈷的培養基模擬。

3.2 細胞轉染： 取指數生長的腫瘤細胞，將HIF-2α的siRNA采用脂質體法轉染至HeLa及SiHa細胞，操作步驟按照LipofectamineTM2000說明書進行。

3.3 免疫組化： 石蠟包埋后，5μm切片，常規免疫組織化學染色，簡述如下：二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，抗原熱修復2 min，3%過氧化氫溶液滅活10 min，滴加HIF-2α一抗(1：100)，4oC 孵育過夜。次日，室溫下復溫30 min，PBS洗滌5 min×3次，加二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

陽性結果判定：按照陽性細胞百分比分為4個等級；1級為 < 25%，2級為25%～50%，3級為50～75%，4級為≥ 75%。按染色強度分為4個等級：0級沒有染色，1級淺棕色，2級棕色,3級暗褐色。染色評分公式：免疫組化評分=百分比評分×染色強度評分。評分≤3為陰性,>3為陽性。

3.4 Western blot 檢測： 參照Bolos V等人描述的方法進行。收集指數生長期的細胞，用RIPA 裂解液(RIPA lysis buffer)冰上裂解細胞30 min，12000 rpm離心15 min，提取細胞總蛋白。BCA法測蛋白濃度后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白，濕法轉至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1 h，滴加一抗(抗HIF-2α 1:500，抗β-actin 1∶1000)，于4oC孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后，用增強化學發光系統(ECL)檢測，暗室曝光，顯影，定影，掃描。

3.5 細胞增殖測定： 將對數生長期的腫瘤細胞接種于96孔板(1×103/孔)，分別在常氧及低氧環境下培養，培養24、48、72、96 h后，每孔加入MTT溶液20 μl(5 g/L, pH=7.4)，繼續孵育4 h，棄上層培養液，每空加入100μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，終止反應，震蕩10min，用酶標儀測定其光吸收值，檢測波長為490nm。

結 果

1 HIF-2α在正常宮頸及宮頸癌組織的表達 采用免疫組化染色法對63例宮頸癌組織及27例正常宮頸組織進行了檢測，如圖1所示，HIF-2α蛋白主要表達在宮頸癌組織的細胞核及細胞漿中，而在正常宮頸組織則表達較少。將染色結果定量分析發現，HIF-2α蛋白在宮頸癌組織的陽性表達率為77.5%，而在正常宮頸組織的陽性表達率僅為16.7%。二者相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖 2。結果表明HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達上調，其可能與宮頸癌的發生、發展有關。

圖1 HIF-2α蛋白在正常宮頸及宮頸癌組織的表達(A：HIF-2α在正常宮頸組織的表達；B：HIF-2α在宮頸癌組織的表達；C：陰性對照;D：陰性對照。×400)

圖2 HIF-2α蛋白在正常宮頸及宮頸癌組織中的陽性表達率(NC：正常宮頸；SCC ：鱗狀宮頸癌。與正常宮頸相比，*P<0.05)

2 HIF-2α表達與宮頸癌患者病理特征的相關分析 HIF-2α蛋白表達與患者的年齡、宮頸癌病理分級以及臨床分期均無顯著性關聯(P>0.05)，而HIF-2α蛋白的表達與宮頸癌淋巴轉移呈明顯正相關，經χ2檢驗，具有統計學意義(P<0.05)，見附表。

附表 宮頸癌中HIF-2α表達與臨床病理特征相關性分析

注：與HIF-2α(-)相比較，*P>0.05, #P<0.05

3 低氧環境對宮頸癌細胞增殖的影響 分別在常氧和低氧環境下培養宮頸癌細胞系HeLa和SiHa細胞，用MTT法分別在24、48、72和96 h檢測細胞的光密度，如圖3所示，結果表明HeLa和SiHa細胞的增殖速度，低氧組均明顯快于常氧組，尤其在72和96 h時，經t檢驗，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖3 低氧環境對宮頸癌細胞增殖的影響(A：低氧對HeLa細胞增殖的影響；B：低氧對SiHa細胞增殖的影響。與常氧組相比較，*P<0.05，**P<0.01)

圖4 低氧環境對HeLa、SiHa細胞中HIF-2α蛋白表達的影響(A：Western blot 檢測HeLa細胞中HIF-2α蛋白表達；B：HIF-2α蛋白表達的定量分析；C：Western blot 檢測SiHa細胞中HIF-2α蛋白表達；D：HIF-2α蛋白表達定量分析。與常氧組相比較，*P<0.05，**P<0.01)

4 低氧環境對宮頸癌細胞中HIF-2α蛋白表達的影響 通過Western blot方法分別檢測低氧組和常氧組HeLa、SiHa細胞中HIF-2α蛋白的表達。結果顯示，在HeLa細胞中HIF-2α在低氧組的表達明顯高于常氧組，見圖4A、B。定量分析后，將HIF-2α蛋白在兩組的表達相比較，具有顯著性差異(P<0.01)。與HeLa細胞中的結果相似，HIF-2α蛋白在SiHa細胞中的表達，其低氧組也明顯高于常氧組，經t檢驗，亦具有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

5 干擾HIF-2α蛋白表達對宮頸癌細胞增殖的影響 通過采用siRNA干擾技術分別沉默HIF-2α蛋白在宮頸癌細胞系HeLa、SiHa細胞中的表達，如圖5A、B。將HeLa和SiHa細胞分別分為對照(siCon)和干擾(siHIF-2α)兩組，然后分別在常氧和低氧環境下培養，即為常氧對照組(常氧siCon)，低氧對照組(低氧siCon)和低氧干擾組(低氧siHIF-2α)。低氧環境采用含300 μmol/L氯化鈷的培養基模擬，常氧環境即普通培養基。如圖5C、D所示，在培養24、48、72和96 h后，通過MTT法分別檢測各組細胞的光密度。結果發現，在72和96 h處，HeLa和SiHa細胞的光密度，在未干擾HIF-2α(siCon)的情況下，其低氧組與常氧組相比，均出現明顯升高，經t檢驗，具有統計學意義(P<0.01)，在低氧環境下培養的HeLa和SiHa細胞，其低氧干擾組(低氧siHIF-2α)的光密度與低氧對照組(低氧siCon)相比，均出現了顯著降低，經t檢驗，亦具有統計學意義(P<0.01)。

圖5 干擾HIF-2α 蛋白表達對HeLa、SiHa細胞增殖的影響(A：Western blot檢測HeLa細胞中HIF-2α 表達；B：Western blot檢測SiHa細胞中HIF-2α 表達；C：MTT法檢測HeLa細胞增殖；D：MTT法檢測SiHa細胞增殖。與低氧對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01)

討 論

近年來，宮頸癌在年輕婦女中的發病率和病死率均有升高的趨勢[5]，因此，深入研究宮頸癌的發病機制具有十分重要意義。低氧是實體瘤發展過程中的一個重要因素，它與腫瘤轉移以及血管發生過程中的許多標志性因子有關，低氧誘導因子則是應對低氧這一反應的關鍵因子。HIF-2α是低氧轉錄因子家族的一個重要成員，它控制著許多在胚胎發育及生理過程中關鍵基因的表達。已有研究表明，HIF-2α在腫瘤進展中起重要作用，但HIF-2α在宮頸癌中的作用目前尚無報道。

本研究通過對27例正常宮頸及63例宮頸癌組織進行免疫組化染色發現， HIF-2α蛋白在宮頸癌組織的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，差異具有統計意義。這說明HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達是升高的，提示HIF-2α蛋白可能與宮頸癌的發生、發展有關。通過分析不同HIF-2α蛋白表達水平與宮頸癌臨床病理特征之間的關系發現，HIF-2α蛋白的表達與宮頸癌的淋巴轉移呈正相關，而與宮頸癌患者的年齡、病理分級及臨床分期無顯著性相關，這表明HIF-2α蛋白可能涉及宮頸癌的轉移，已有研究報道表明，HIF-2α蛋白在腫瘤中的表達升高與腫瘤的血管生成及不良預后有關[6]，本研究結果也從另一方面證實HIF-2α蛋白在宮頸癌進展中具有重要作用。

低氧環境是實體瘤細胞經常面臨的一種環境，惡性腫瘤細胞具有適應并在低氧環境下生長的能力[4]。本研究發現低氧能促進宮頸癌細胞系HeLa、SiHa細胞的增殖，由于惡性腫瘤細胞對低氧的適應以及應答都與低氧誘導因子家族有關。通過Western blot檢測發現，在低氧環境下，HeLa、SiHa細胞中HIF-2α蛋白表達水平與常氧環境相比，差異具有統計學意義。這表明低氧促進宮頸癌細胞的增殖可能與細胞中HIF-2α蛋白表達水平升高有關。

為進一步檢驗HIF-2α蛋白表達對宮頸癌細胞增殖的影響，通過siRNA技術干擾HIF-2α蛋白在宮頸癌細胞系HeLa、SiHa細胞中的表達，然后分別進行細胞增殖實驗。結果發現，低氧對照組中HeLa和SiHa細胞的增殖速度明顯高于常氧對照組，進一步證實了低氧能促進宮頸癌細胞的增殖。然而，低氧干擾組中HeLa和SiHa細胞的增殖速度與低氧對照組相比，卻明顯降低，表明干擾HIF-2α蛋白表達能導致宮頸癌細胞增殖的顯著抑制，這表明HIF-2α蛋白在促進宮頸癌細胞增殖中具有重要作用。有研究表明，在低氧環境中，HIF-2α蛋白表達增加，通過與靶基因的低氧反應元件(HREs)結合，誘導靶基因的轉錄激活，這些靶蛋白往往涉及低氧耐受或血管生成。在宮頸癌組織中，局部低氧環境可能誘導HIF-2α蛋白表達增加，HIF-2α進一步通過誘導一系列相關蛋白的表達，促進宮頸癌的發展。這也與一些研究表明HIF-2α可通過誘導VEGF表達，促進腫瘤的進展相一致[7]。

綜上所述，本研究通過檢測HIF-2α蛋白在正常宮頸及宮頸癌中的表達，結果表明HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達升高，并證實HIF-2α蛋白能促進宮頸癌細胞的增殖，這說明HIF-2α蛋白可能在宮頸癌的發生、發展中起著重要作用，這將為宮頸癌的治療提供新的生物靶點。

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[2] Aouadi M. HIF-2α blows out the flames of adipose tissue macrophages to keep obesity in a safe zone [J]. Diabetes, 2014, 63(10):3169-3171.

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[5] Cai HB, Liu XM, Huang Y,etal.Trends in cervical cancer in young women in Hubei, China [J]. Int J Gynecol Cancer, 2010, 20 (7): 1240-1243.

[6] Cuvillier O, Ader I, Bouquerel P,etal. Hypoxia, therapeutic resistance, and sphingosine 1-phosphate [J]. Adv Cancer Res, 2013, 117:117-141.

[7] Zhao D, Zhai B, He C,etal. Upregulation of HIF-2α induced by sorafenib contributes to the resistance by activating the TGF-α/EGFR pathway in hepatocellular carcinoma cells [J]. Cell Signal, 2014, 26(5):1030-1039.

(收稿：2015-02-27)

The significance of HIF-2α expression in cervical cancer

Department of Gynecological Oncology, Shaanxi Provincial Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Yuan Yuan Chang Xiaobin Yao Anmei et al

Objective: To explore the expression of HIF-2α in cervical cancer and its role in the cervical cancer initiation and progression. Methods: The expression of HIF-2α in cervical cancer and normal cervix were measured using immunohistochemistry, and the correlation between HIF-2α and clinicopathological parameter of cervical cancer was analyzed. HIF-2α expression in HeLa and SiHa cells were measured by western blot assay and HIF-2α in HeLa and SiHa cells were knocked down by siRNA technology. Subsequently, cell proliferation assay were performed by MTT. Results: The expression of HIF-2α in cervical cancer was significantly increased compared with the normal cervix , and HIF-2α expression was positively correlated with lymphatic metastasis of cervical cancer, but the significant correlation between HIF-2α expression and age, pathological grade, clinical stage of patients were not observed. Hypoxia induced the expression of HIF-2α and promoted cell proliferation of HeLa and SiHa cells, but the knockdown of HIF-2α resulted in a significant inhibition of cell proliferation.Conclusion: HIF-2α expression in cervical cancer is significant increased, and HIF-2α promoted the initiation and progression of cervical caner.

Uterine cervical neoplasms/pothology Hypoxia-inducible factor 2,alpha Gene expression

子宮頸腫瘤/病理學 缺氧誘導因子2，α亞單位 基因表達

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.008

△陜西省腫瘤醫院放療科