HBV在卵巢組織及卵細胞中復制的實驗研究

陜西省人民醫院消化內一科(西安710068)

金 燕 邱 婷 呂頤菲 閆春英 王 雪 劉貴生

HBV在卵巢組織及卵細胞中復制的實驗研究

陜西省人民醫院消化內一科(西安710068)

金 燕 邱 婷 呂頤菲 閆春英 王 雪 劉貴生

目的：尋找尋找卵細胞感染HBV的直接證據及影響因素。方法：檢測卵巢及卵細胞中HBcAg、HBV DNA 和HBV mRNA的分布情況。研究血清中HBeAg陽性和HBV DNA水平與HBV感染卵巢及卵細胞的關系。結果： 在卵巢顆粒細胞和卵細胞內發現了HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA分布。血清HBeAg與否和HBV DNA水平高低與卵巢及卵細胞中HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA陽性率無關。 結論：HBV可以在卵巢和卵細胞內復制，這意味著被感染的卵細胞一旦受精成功就很有可能將HBV帶入胚胎發生垂直傳播。血清HBeAg與否和HBV DNA水平與卵巢及卵細胞感染HBV無關。

乙型病毒性肝炎(乙型肝炎)是一種嚴重危害人類健康的世界性疾病，截至目前全球約有20億人既往或持續感染HBV(乙肝病毒)，其中3.5～4億人為慢性HBV感染者。HBV母嬰傳播是造成HBV感染慢性化的主要原因。隨著孕期和新生兒注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)和接種乙肝疫苗(HBVac)明顯降低了母嬰傳播率，但是仍有部分患者不能通過上述方法阻斷[1-3]。研究顯示,經HBV卵細胞垂直傳播可能是主要原因,因此需要研究卵巢和卵細胞中的HBV復制活性以利于HBV母嬰傳播機制的深入探討。另一方面，既往的研究認為孕產婦HBV DNA高水平及HBeAg陽性是造成HBV母嬰傳播感染的主要因素，通過孕前、孕中降低HBV DNA水平和使HBeAg轉陰可以減少母嬰傳播的發生[4-5]。且有研究也發現HBV DNA病毒復制水平和血清HBeAg與肝外組織病變有明確相關性[6-7]。

本研究擬通過檢測卵巢及卵細胞中HBcAg、HBV DNA 和HBV mRNA的分布情況，分析HBV在卵巢組織中尤其是卵細胞中的復制情況。并進一步研究血清中HBeAg陽性和HBV DNA水平與HBV感染卵巢及卵細胞的關系，深入探討HBV經卵細胞垂直傳播的機制。

材料和方法

1 研究對象 選擇2008年7月至2010年6月在西安交通大學第一附屬醫院和陜西省婦幼保健院因婦科疾病且患有慢性乙肝需要手術切除的50例患者的卵巢組織。患者平均年齡38歲，婦科疾病分別為：卵巢囊腫18例，異位妊娠2例，卵巢畸胎瘤6例，子宮惡性腫瘤24例。同時選擇6例無乙肝病毒感染的卵巢組織作為陰性對照。所有乙肝患者均經臨床診斷確診為慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎攜帶者，診斷符合以2000年全國病毒性肝炎學術會議(西安)修訂的慢性病毒性肝炎的診斷標準,并且所有患者未接受正規抗病毒治療。

所有患者在手術前于肘靜脈處抽取10ml靜脈血，分別用于血清HBV DNA定量檢測，和HBVM檢測。同時檢測患者血清中HAV、HCV、HDV和HIV抗體，排除有上述病毒的感染。

2 研究方法

2.1 血清HBV DNA定量檢測。

2.2 免疫組化檢測卵巢中HBcAg。

2.2.1 制片：新鮮卵巢組織置冰上，用DEPC水處理過的手術刀將標本切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小組織。沖洗-固定-脫水-透明和包埋-連續切片。

2.2.2 免疫組化：先用PBS沖洗；阻斷內源性過氧化物酶的活性。與一抗反應，然后PBS洗3次每次各5min。與二抗反應,DAB顯色，脫水干燥。二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.2.3 陽性對照：選擇乙肝患者的肝穿標本，并通過病理學檢查診斷為慢性活動性肝炎的肝組織。

2.2.4 陰性對照：乙肝陰性的正常對照組的卵巢； PBS代替一抗；不加一抗的空白對照；用PBS代替二抗；不加二抗的空白對照。

2.2.5 結果判斷：雜交陽性信號主要位于胞漿中呈棕黃色。

2.3 mRNA原位雜交。

2.3.1 取材和切片標本的制備同前。

2.3.2 原位雜交:脫蠟，用蛋白酶稀釋液將胃蛋白酶溶解后滴在切片組織上，脫水; 預雜交；雜交：加雜交液20 μl/每張切片，含10ng探針，42℃過夜；DNA雜交95℃10min變性，使DNA雙鏈解開，迅速置于冰上1min，隨后42℃過夜 (16～18 h) ；終止；顯色， 復染，脫水、透明、封片。

2.3.3 陽性對照：選擇乙肝患者的肝穿標本，并通過病理學檢查診斷為慢性活動性肝炎的肝組織。

2.3.4 陰性對照：乙肝陰性的正常對照組的卵巢；雜交時未加入雜交探針；用PBS代替抗-DIG抗體；在雜交前用RNA酶將標本37℃過夜。

2.3.5 結果判斷:mRNA雜交陽性信號主要位于胞漿中呈紫蘭色，細胞核呈紅色。DNA雜交陽性信號位于胞核中呈棕黃色或黃色。

結 果

1 血清中HBV DNA和HBVM結果分析 根據檢測血清中HBV DNA定量的結果，將實驗組分為低復制組(HBV DNA定量≤104IU/ml)和高復制組(HBV DNA定量>104IU/ml)。同時根據HBeAg分為陽性組和陰性組。

2 卵巢中HBcAg檢測結果 以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。再次在卵巢組織中卵母細胞和卵巢顆粒細胞的胞漿和胞膜中發現棕黃色HBcAg的陽性信號陽性率14%(7/50)，且分布位置無變化，見圖1。

3 卵巢中HBV DNA檢測結果 以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。在實驗組中顆粒細胞和不同發育階段的卵母細胞胞核內發現黃色HBV DNA的陽性信號，陽性率為12%(6/50)，見圖2。陰性對照、空白對照和替代對照均未顯示陽性信號。

4 卵巢組織中mRNA原位雜交結果 鏡下陽性表達判斷標準以細胞胞漿內出現蘭紫色顆粒為陽性細胞。在卵巢顆粒細胞和卵細胞內陽性信號。分布于細胞漿中，見圖3、4。陽性率為6%(3/50)。HBV mRNA原位雜交的陰性對照、空白對照和替代對照均未顯示陽性信號，見圖3。

5 卵巢中HBV標志物檢出與血清HBeAg和HBV DNA的關系 卵巢組織中檢測出HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA檢測結果與患者血清中HBeAg關系，見表1。用統計學軟件分析HBeAg與卵巢組織中各項乙肝標志物檢出率的關系后，結果顯示血清中HBeAg陽性組和陰性組之間卵巢中HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA陽性率均無明顯差異(P= 0.409、0.697、0.602)。

表1 HBcAg、HBVDNA 、HBV mRNA陽性信號的患者與血清中HBeAg關系

卵巢中HBcAg陽性陰性陽性率 卵巢中HBVDNA陽性陰性陽性率 卵巢中HBVmRNA陽性陰性陽性率HBeAg(+) 42014．3%42021．4%22214．3%HBeAg(-)2246．25%32312．5%1254%總數64412%74314%3476%

HBV DNA水平104IU/ml為分界限分為低復制組和高復制組，同樣用Fisher精確概率法分析，認為兩組間的卵巢中HBcAg、HBV DNA、HBV mRNA陽性率的差異無明顯統計學意義(P= 0.674、1、1)。

表2 HBV DNA水平與HBcAg、HBVDNA 、HBV mRNA陽性率的關系

討 論

HBV雖是一種嗜肝病毒，但是近十年，人們已經陸續在許多肝外組織中發現了乙肝病毒的存在的證據。本研究項目[8]在卵細胞和卵巢顆粒細胞中發現了HBV DNA存在和HBV蛋白表達。證實HBV可以感染卵巢中的卵細胞，但尚未有證據證實這些HBV片段具有復制活性，只有具有生物學活性的HBV DNA片段才能重新組裝成共價閉合環狀DNA并以此為模板轉錄mRNA，并與聚合酶一起被核衣殼包裹成核心顆粒并進而與外膜蛋白包裝成Dane顆粒并重新感染新的子代。這樣才有可能發生真正意義上的HBV經卵細胞的母嬰垂直傳播。因此，進一步證實卵細胞中的HBV具有復制活性對深入研究HBV經卵細胞垂直傳播的機制具有重要意義。

HBcAg在胞漿中合成后轉入核內，在HBV DNA高表達時即行裝配，與病毒活躍復制密切相關，HBcAg的檢出也是HBV在卵細胞中復制和表達的標志。HBV DNA是明確的復制指標。HBV mRNA既是逆轉錄模板又是翻譯模板，因此HBV mRNA是HBV復制和表達的中間環節。本研究在卵巢組織及卵細胞中發現了HBcAg、HBV DNA和HBV RNA，分別從不同的層面證實在卵巢組織中尤其是卵細胞內存在的HBV具有復制活性。我們有理由認為具有復制活性的HBV的卵細胞與正常人精子受精后，極有可能發生經卵細胞母嬰傳播。

影響HBV母嬰傳播的因素眾多，如胎盤屏障作用、孕母及新生兒的遺傳易感性等。大部分研究結果證實孕產婦HBV DNA高水平及HBeAg陽性是造成HBV母嬰傳播感染的主要因素[9-10]。但在臨床中我們觀察到一些HBeAg陰性和HBV DNA低水平復制的孕婦即使在孕期接種HBIG也會免疫失敗造成母嬰傳播。本研究分析了血清HBeAg陽性和HBV DNA復制水平與卵巢中HBV陽性檢出率的關系，根據統計學得出提示血清HBeAg陽性和HBV DNA水平與卵巢中HBV的感染無明顯關系。而上述人群母嬰傳播的阻斷失敗發生的極有可能與卵細胞感染了HBV相關，也可以說，目前手段對阻斷經卵細胞垂直傳播無效，這就要求我們通過深入研究HBV經卵細胞垂直傳播機制尋找新的手段來降低HBV的母嬰傳播率。

總之，HBV不但可以在卵細胞和卵巢顆粒細胞內復制而具有生物學活性。這就意味著一旦這些卵細胞受精成功發育為胚胎將很有可能在其內復制并進一步發生垂直傳播。且這種復制與患者血清HBeAg陽性與否和HBV DNA水平高低與卵巢HBV感染率無關，因此，目前所采用阻斷措施對該途徑無效，需要進一步探索其機制來研究新的方法來控制經卵細胞的HBV母嬰傳播。

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[3] Yang YJ, Liu CC, Chen TJ,etal. Role of hepatitis B immunoglobulin in infants born to hepatitis B e antigen-negative carrier mothers in Taiwan [J]. Pediatric Infectious Disease Journal, 2003, 22(7): 584-588.

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(收稿：2015-02-12)

乙型肝炎病毒 卵子 病毒復制 傳染病傳染，垂直

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.006