蘿卜硫素對分化型甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘能力的影響

西安市中心醫(yī)院內分泌科(西安710003)

王麗萍

蘿卜硫素對分化型甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘能力的影響

西安市中心醫(yī)院內分泌科(西安710003)

王麗萍

目的：研究蘿卜硫素對分化型甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘能力的影響。方法：選擇乳頭狀甲狀腺癌細胞系K1及濾泡狀甲狀腺癌細胞系FTC133進行體外培養(yǎng)，給予不同濃度蘿卜硫素處理24h，通過反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測鈉/碘同向轉運體(NIS) mRNA的表達；通過γ計數(shù)儀檢測甲狀腺癌細胞攝碘能力。結果：反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測結果表明，蘿卜硫素可以上調NIS基因的表達，并呈濃度依賴性；γ計數(shù)儀檢測結果表明，蘿卜硫素可以提高分化型甲狀腺癌的攝碘能力。 結論：蘿卜硫素為放射性碘治療分化型甲狀腺癌提供了新的思路。

在甲狀腺癌的臨床治療中，化療藥物對其不敏感，而對于分化型甲狀腺癌，放射性碘治療療效確切。因此，如何提高分化型甲狀腺癌細胞的攝碘率成為研究熱點。鈉/碘同向轉運體(Sodium/Iodide Symporter，NIS) 是一種跨膜糖蛋白，主要位于甲狀腺濾泡細胞的基底膜上，是甲狀腺濾泡細胞攝碘的分子基礎。本研究以人分化型甲狀腺癌細胞系K1、FTC133為研究對象，了解蘿卜硫素對分化型甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘率的影響。

材料和方法

1 材 料

1.1 細胞株：人甲狀腺癌細胞系FTC133, K1由中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 試劑：胎牛血清(FBS)：購自HyClone, Lot: NWCO389。非必需氨基酸：購自Gibco, Lot:1171639。丙酮酸鈉：購自Gibco, Lot:1228076。中性蛋白酶：Gibco分裝。D-MEM/F-12，RPMI Medium 1640：均購自Gibco, Lot:1294292、1250959。使用前每500 ml D-MEM/F-12培養(yǎng)基分別加入10%的FBS；每500 ml RPMI Medium 1640培養(yǎng)基分別加入10%的FBS，5 ml非必需氨基酸，5 ml丙酮酸鈉，配置成完全培養(yǎng)基，過濾除菌，4℃保存。0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液：購自Gibco, Lot:1123262。二甲亞砜(DMSO)：購自MP Biomedicals，Lot:M4300，常溫避光保存。蘿卜硫素(L-Sulforaphane)：購自Cayman。

1.3 儀器：CO2細胞孵育箱(購自Thermo Scientific)，倒置顯微鏡XD-202(購自江南光學儀器廠)，CFX96熒光定量PCR儀(購自美國Biorad公司)，γ計數(shù)儀(購自上海上立檢測儀器廠)。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的細胞，以3×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后待懸浮細胞貼壁，加入不同濃度蘿卜硫素(5μM、10μM、20μM、40μM)，作用24 h后收集細胞進行相關指標的檢測。

2.2 反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)，RT-qPCR通過檢測反應液中 SYBR Green I 的熒光強度，達到監(jiān)控 PCR 產(chǎn)物擴增量的目的。SYBR?Green I與雙鏈DNA結合后發(fā)出熒光，所以可以通過檢測反應體系中的SYBR?Green I熒光強度，達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。NIS上游引物序列為5'-CCTGCTAACGACTCCAGCA-3'，下游引物序列為5'-CCAGGGCACCGTAATAGAGA-3'，18s作為內參，上游引物序列為5'-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3'，下游引物序列為5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'。

2.3 計數(shù)儀檢測細胞攝碘能力：蘿卜硫素作用24 h后用小試管收集細胞，調整細胞數(shù)，使每管的細胞個數(shù)為5×105個。離心后棄上清，預冷PBS清洗2次。向每個試管加入l ml含125I的HBSS溶液(含37kBq125I)，置于37℃孵箱1 h，離心棄掉上清液，以HBSS洗2次，γ計數(shù)儀檢測細胞攝碘水平。

結 果

1 RT-qPCR檢測NIS mRNA 分別給予K1及FTC133細胞不同濃度的蘿卜硫素處理24 h，結果顯示，蘿卜硫素可上調NIS mRNA水平，并且呈劑量依賴性(圖1)。

圖1 蘿卜硫素對K1及FTC133細胞NIS mRNA表達的影響(***P<0.001)

圖2 蘿卜硫素對K1及FTC133細胞攝碘率的影響

2 γ計數(shù)儀檢測細胞攝碘能力 分別給予FTC133和K1細胞不同濃度蘿卜硫素處理24h，結果5μM，10μM及20μM蘿卜硫素對K1 細胞的攝碘率無明顯作用，40μM蘿卜硫素可明顯提高K1細胞系攝碘率(P<0.001)；而10μM蘿卜硫素即可提高FTC133細胞攝碘率，且隨濃度的增加而增加(圖2)。

討 論

分化型甲狀腺癌(DTC)占甲狀腺癌的90%左右，大多數(shù)分化型甲狀腺癌患者，經(jīng)手術、放射性碘以及甲狀腺素制劑替代治療后預后良好。鈉/碘同向轉運體(NIS)是一種糖蛋白，位于甲狀腺濾泡細胞基底膜上，可以將血液中的-I選擇性、主動性地轉運至濾泡上皮細胞中，-I 經(jīng)過氧化物酶作用后，碘化甲狀腺球蛋白(Thyrogloulin，Tg)上的酪氨酸殘基，儲存在腺泡腔內，通過溶酶體的作用，分解成甲狀腺激素，以囊泡的形式釋放到血液中， 調節(jié)全身的新陳代謝。DTC 濃聚131I的能力， 對其治療有著非常重要的意義。131I治療成為DTC術后處治的重要手段，但仍有約30%復發(fā)和轉移，而且遠處轉移的患者，病灶對131I存在抵抗[1]。其原因是多方面的：有NIS基因突變、NIS mRNA減少、NIS蛋白表達異常、TSH受體突變、多次131I治療后DTC細胞的退行性變，導致了攝碘功能的減低。Smit等[2]將hNIS基因轉染入帶有hNIS缺陷的濾泡性甲狀腺癌細胞系FTCl33中，實驗表明轉染細胞對131I攝取增強。Shimura等[3]把rNIS的eDNA表達質粒轉染喪失聚碘功能的鼠甲狀腺細胞(FRTL-Tc)中，發(fā)現(xiàn)轉染細胞(Tc-rNIS)在離體情況下具有聚碘能力。因此，如何提高攝碘率為放射性碘治療分化型甲狀腺癌提供了新的思路。

組蛋白氨基端賴氨酸殘基的乙酰化可降低其與DNA的親和力，從而影響組蛋白與DNA的結合。組蛋白脫乙酰化酶抑制劑[Histone-deacetylase(HDAC)inhibitors]可以在轉錄后水平增強NIS基因表達。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)對甲狀腺癌細胞系給予一種HDAC抑制劑Triehostatin A(TSA)干預，腫瘤細胞NIS表達顯著增加，得出結論TSA治療與三種細胞系NIS表達增強存在直接關系[4]。蘿卜硫素富含于十字花科植物，屬于異硫氰酸鹽類。有研究顯示蘿卜硫素可作為HDAC抑制劑發(fā)揮抗癌作用[5-6]。本實驗中，給予不同濃度的蘿卜硫素處理分化型甲狀腺癌細胞系K1及FTC133，結果表明，蘿卜硫素可上調NIS mRNA，并呈劑量依賴性，提高腫瘤細胞的攝碘率。若能夠通過應用蘿卜硫素的誘導分化作用，誘導NIS基因的表達，促進甲狀腺癌細胞向成熟階段分化，恢復或提高其攝碘能力，然后再結合放射性碘的聯(lián)合治療模式，則可能獲得滿意的臨床效果。

本實驗是建立在體外細胞培養(yǎng)的基礎上得出的結論，缺少體內研究結果的證實。蘿卜硫素作用的機制尚不清楚，是否是通過HDAC抑制劑發(fā)揮作用，還需進一步的實驗證實。

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(收稿：2015-03-02)

Effect of sulforaphane on sodium/iodide symporter gene expression and radioidide uptake of differentiated thyroid cancer cell line

The Department of Endocrinology, Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003)

Wang Liping

Objective: To study the effect of Sulforaphane on sodium/iodide symporter gene expression and radioidide uptake of differentiated thyroid cancer cell line. Method: the thyroid cancer cell line K1 and FTC133 were treated with different concentrations of sulforaphane for 24h,the expression level of NIS mRNA of K1 and FTC133 were determined by RT-qPCR and their radioiodide concentration activity were measured by γ-counter. Results: Sulforaphane can up-regulate the expression of NIS in a dose-dependent manner and also increase the ability of radioiodide concentration of differentiated thyroid cancer line. Conclusion:Sulforaphane provides a new idea for radioactive iodine treatment of differentiated thyroid cancer.

Thyroid neoplasms/therapy Thiocyanates Glycophorins Iodine radioisotopes Gene expression

甲狀腺腫瘤/治療 硫氰酸類 糖蛋白類 碘放射性同位素 基因表達

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.003