吳茱萸堿對大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白表達的影響*

陜西中醫學院免疫及檢驗學教研室(咸陽712046)

施京紅 王 萍 胥 冰 張麗君 丁 輝△

·論著·基礎研究·

吳茱萸堿對大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白表達的影響*

陜西中醫學院免疫及檢驗學教研室(咸陽712046)

施京紅 王 萍 胥 冰 張麗君 丁 輝△

目的：研究吳茱萸堿(Evo)對大鼠下丘腦弓狀核神經肽Y(NPY)蛋白表達水平的影響。方法：選用雄性5周齡Sprague-Dawly大鼠36只，分為對照組、Evo 4mg/kg組、40 mg/kg組。Evo灌胃25d后取材；采用免疫組織化學和蛋白免疫印跡的方法，觀察Evo對下丘腦弓狀核中NPY免疫陽性產物的表達和NPY蛋白水平的影響。結果：吳茱萸堿40 mg/kg干預后，下丘腦弓狀核NPY-IR陽性細胞數顯著減少，同時NPY蛋白表達水平顯著降低。結論：Evo可顯著降低大鼠下丘腦弓狀核促食欲肽NPY蛋白水平，提示下丘腦可能是Evo調節攝食行為的重要中樞。

吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實中提取的一種主要生物堿成分，具有多種藥理學效應，如降低體重、調節體溫、抑制腫瘤、鎮痛及對心血管和內分泌系統的作用[1-4]。下丘腦及其回路在調制與攝食有關的內環境穩態信號中起著重要作用，是調節攝食和能量代謝的主要中樞。弓狀核(The arcuate nucleus，ARC)是下丘腦中調控攝食與體重的重要核團，包含促進攝食反應和誘導厭食反應的神經元功能區。NPY釋放的階段性升高和降低與食欲的啟動與終止有關。我們前期研究表明，Evo能降低下丘腦促食欲肽NPY mRNA的表達，但是，Evo是否影響下丘腦ARC中NPY蛋白水平的表達尚不清楚。我們推測下丘腦可能是Evo發揮降低體重作用的主要中樞位點。本研究采用免疫組織化學法(Immunohistochemistry)和蛋白免疫印跡(Western Blotting)的方法，觀察Evo對下丘腦弓狀核中NPY免疫陽性產物的表達和NPY蛋白水平的影響。

材料與方法

1 試 劑 Evo購自陜西匯生醫藥科技有限公司，純度99.24%，用雙蒸水配制成混懸液。①免疫組化實驗試劑：10%小牛血清，武漢博士德生物公司；兔抗大鼠NPY多克隆抗體(bs-0071R)，北京博奧森生物技術有限公司；生物素標記的羊抗兔IgG二抗(HRP)，武漢博士德生物技術公司；②Western Blotting實驗試劑：兔抗大鼠NPY多克隆抗體，Chemicon，AB9608，USA；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體，武漢博士德生物技術公司；山羊抗兔IgG(H&L)二抗(HRP)，武漢博士德生物技術公司；山羊抗小鼠IgG(H&L)二抗(HRP)，武漢博士德生物技術公司。

2 實驗方法

2. 1 動物及實驗操作：選用雄性5周齡Sprague-Dawly大鼠36只，初始體重60～80g。動物房溫度20～22°C，光暗周期為12∶12 h(8：00-20：00)，自由飲食。大鼠被隨機分為三組：每組12只。適應實驗室條件及實驗操作1周后，于上午10：00灌胃。大、小劑量組分別以Evo 40 mg/kg、4 mg/kg劑量灌胃，對照組灌以雙蒸水。按1 ml/100g溶液體積根據大鼠體重灌胃，速度為1 ml/5 s，1次/d，共灌胃25 d。動物處死取材在上午10:00-12:00進行。大鼠進行完前述實驗后，在烏拉坦麻醉下(1.2 g/kg, 腹腔注射)取材。

2.1.1 NPY的免疫組織化學染色：開胸暴露心臟，經左心室插管至升主動脈，先以0.0l mol/L PBS(pH 7.4)100 ml快速灌注沖去血液，繼之以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH 7.4)灌注固定液250 ml快速灌注固定，然后再以同樣的灌注固定液250 ml緩慢滴注，持續l .5～2 h。灌注完畢后開顱取腦組織，并將所取的腦組織置于上述新鮮固定液中后固定4 h(4℃)，然后將腦組織移入含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中(4℃)過夜。待腦組織在蔗糖中完全沉底后，石蠟包埋。

2.1.2 Western Blotting檢測：開顱骨取腦，在冰生理鹽水中沖洗并在解剖顯微鏡下切取雙測下丘腦ARC，迅速投入液氮中。將所取組織凍存于-80℃冰箱，以備檢測。

2.2 NPY的免疫組織化學染色：取各組大鼠腦組織在石蠟切片機上冠狀切取下丘腦含弓狀核腦區，片厚7 μm，按照切片順序隔2張取1張，切片分三組收集于含0.01 mol/L PBS(pH 7.4)的碟子中備用，每組通常包含16～18張腦組織切片。取第一套切片，按SP法免疫組化檢測試劑盒的使用流程進行NPY的免疫組織化學染色。取第二套切片進行Nissl染色。以便對照觀察免疫組織化學染色標記的神經元的位置。取第三套組腦組織切片，省略或用正常兔血清替代兔抗大鼠NPY抗體，后續步驟同前，進行對照實驗，沒有陽性結果被檢測。圖像信號采集分析系統對切片進行觀察，NPY陽性表達呈棕黃色，正常胞核蘇木素復染后呈藍色(圖1)。為了防止計數的假陽性及重復計數，只有那些具有足夠亮度且能觀察到胞體的神經元才被記錄。而不能清楚分辨的神經元則一律舍棄不計。因此，NPY免疫陽性標記神經元數僅代表最少數量的免疫陽性神經元。

2.3 Western Blotting檢測：取出待測組織，每個樣品取20 mg左右，按20 mg/ml比例加入RIPA蛋白裂解液，同時添加Proteinase inhibitor cocktail(終濃度為40 μl/ml)和STI(終濃度為0.1 mg/ml)，得到組織樣本的總蛋白，儲存于-80℃備用，或用于含量的測定。使用BCA法進行蛋白定量。每泳道加樣量均為30 μg，經過SDS-PAGE電泳，轉膜，一抗孵育，二抗孵育后，ECL發光并且X膠片曝光。全自動凝膠成像系統對X膠片進行掃描分析并拍照，蛋白相對表達量用光密度表示，以GAPDH一抗作為參照來糾正加樣誤差。

結 果

1 免疫組織化學染色結果 在研究的三組動物中，均可在下丘腦弓狀核內觀察到呈現棕黃色的NPY免疫陽性的產物分布，主要在神經元胞漿中，并且該免疫陽性的神經元主要呈圓形，部分為不規則形狀，直徑大約15～20 μm(圖1)。Evo 40 mg/kg干預后，下丘腦弓狀核NPY陽性細胞數與對照組相比顯著減少(P= 0.001)，Evo 4 mg/kg干預后，陽性細胞數與對照組無統計學差異(P> 0.05)(圖2)。

圖1 免疫組化染色結果顯示不同處理組下丘腦弓狀核內NPY免疫陽性的表達(NPY免疫陽性的產物分布在ARC內的神經元的胞漿，呈棕黃色，多數為圓形，部分為不規則形。其中，A為下丘腦ARC的Nissl染色圖；B、C和D分別為對照組、Evo 4 mg/kg干預組和Evo 40 mg/kg干預組ARC內的NPY免疫組化染色的高倍放大圖。標尺：A = 400μm，B、C、D = 50 μm)

2 Western Blotting結果 應用Western Blotting方法檢測了下丘腦弓狀核促攝食肽NPY的表達(圖3)。Evo 40 mg/kg干預后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比顯著降低(P< 0.05)；Evo 4 mg/kg干預后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比無顯著變化(P> 0.05)(圖4)。

圖2 Evo 40 mg/kg干預大鼠后，下丘腦弓狀核NPY陽性細胞數顯著少于對照組(***P=0.001)；Evo4mg/kg干預后陽性細胞數與對照組比較無統計學差異(P>0.05)

圖3 各組NPY免疫印跡條帶[1：對照組；2：Evo 4 mg/kg處理組；3：Evo 40 mg/kg處理組。用藥組隨著用藥量的增大，NPY的表達量逐漸降低。NPY Mol wt: 8 kDa(NPY抗體是以Ncbi 數據庫中NPY-97個氨基酸序列為標準設計的，包含前信號肽，抗原結合位點是：P-G-D-E-A-P-A-E-D-M-A-R-Y)，內參GAPDH：36 kDa]

圖4 Evo對下丘腦ARC中NPY蛋白水平的影響 (Evo 40 mg/kg干預后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比，差異有統計學意義；Evo 4 mg/kg干預后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比，差異無統計學意義)

討 論

我們的研究顯示，Evo 40 mg/kg灌胃，大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白水平表達與對照組相比顯著降低。前期研究結果[5-6]顯示,Evo干預后大鼠攝食量及體重顯著下降，血清Leptin水平增高，顯著抑制下丘腦NPY mRNA的表達，因此，我們認為Evo抑制NPY蛋白水平的表達在抑制攝食中發揮關鍵作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo調控攝食、體重的機制中發揮關鍵作用。

實驗證明，ARC-PVN軸NPY釋放增加與攝食行為的啟動有關，禁食時NPY增加。應用藥理學、生理學或基因干預的方法，實驗性降低NPY與其受體Y1、Y5的作用可以抑制食欲，說明NPY是大腦的自然食欲發生器[7-9]。EVO通過散熱和產熱分散食物熱量，增加能量消耗，抑制內臟周圍脂肪和體重增加[10]。NPY是生理性食欲啟動子，下丘腦NPY釋放的異常，可產生過食、能量消耗的降低及一系列新陳代謝性疾病。因此，針對ARC-PVN神經軸，研究有效調控NPY的藥物，避免或減緩這些疾病的發生和發展是臨床迫在眉睫的課題。

轉基因肥胖模型中，NPY不適當和無限制地過度表達引起肥胖，這是由于Leptin對這些神經元的正常抑制作用缺失所導致，包括：①ob/ob小鼠：無生物功能Leptin；②db/db小鼠和fa/fa fatty Zucker大鼠：Leptin受體突變[11-12]。在這些模型中，NPY mRNA表達增加伴隨NPY蛋白水平在ARC、PVN、DMH核團中增高，結果與禁食和IDDM模型表現一致[13]。

在本研究中，Evo 40 mg/kg顯著下調大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白水平的表達，而我們的前期結果顯示Evo明顯升高血清Leptin水平，顯著抑制下丘腦NPY mRNA的表達，因此，我們認為Evo抑制NPY蛋白水平的表達在抑制攝食中發揮關鍵作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo調控攝食、體重的機制中發揮關鍵作用。

[1] Wang T, Wang Y, Kontani Y,etal. Evodiamine improves diet-induced obesity in a UCP1-independent manner: Involvement of anti-adipogenic mechanism and ERK/MAPK signaling[J]. Endocrinology, 2008, 149:358-366.

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[6] 施京紅，閆劍群，丁 輝. 吳茱萸堿對大鼠體重及血清瘦素水平的影響[J]. 陜西中醫，2009，30(10)：1425-1426.

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[8] Kalra SP, Kalra PS. Neuropeptide Y: A conductor of the appetite-regulating orchestra in the hypothalamus. In: Kastin AJ, editor. The handbook of biologically active peptides. Burlington, MA: Academic Press; 2006.

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(收稿：2014-11-07)

Influence of evodiamine on the expresstion of peptide NPY in hypothalamic ARC in rats

Department of Medical Techniques, Immunology and Science of Inspection Teaching and Research Section,Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Shi Jinghong Wang Ping Xu Bin et al

Objective: To investigate the effect of evodiamine (Evo) on the expresstion of peptide NPY in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus in rats. Methods: Male Sprague-Dawley rats (5 weeks old,n=36) were randomly divided into three groups (n=12). Intragastric administration of Evo 40 mg/kg, Evo 4 mg/kg or water was infused for 25 days, once a day. We evaluated the effect of Evo on NPY peptide expression. NPY was detected by immunohistochemistry in cytoplasm of the hypothalamic ARC. The expression of peptide NPY in hypothalamic ARC was measured by Western Blotting. Results: The frequency of NPY-IR neurons of Evo 40 mg/kg was significantly smaller than control group. The expression of orexigenic peptide NPY in hypothalamic ARC of the animals treated with Evo 40 mg/kg (Ratio of light density between NPY and GAPDH) had a noticeable drop compared with the control group. Conclusion: Our results show that intragastric administration of Evo (40 mg/kg) decreased orexigenic NPY peptide level in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus. This is one of the most important mechanisms of Evo in the hypothalamus.

Evodiamine/pharmacology NeuropeptideY Arcuate nucleus Hypothalamus Immunohistochemistry Rats

* 陜西省教育廳課題(2010JK489)

吳茱萸堿/藥理學 神經肽Y 弓狀核 下丘腦 免疫組織化學 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.001

△ 陜西省中醫醫院