循環MPs對pH大鼠肺動脈舒張功能的影響*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科 (西安 710061)

韓穩琦 陳春燕 韓新源△ 潘軍強△ 程 功△ 孫超峰#

循環MPs對pH大鼠肺動脈舒張功能的影響*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科 (西安 710061)

韓穩琦 陳春燕 韓新源△潘軍強△程 功△孫超峰#

目的： 探討肺動脈高壓大鼠體內循環微顆粒(MPs)對肺動脈血管舒張功能的影響，以進一步闡述肺動脈高壓的發病機制。方法：雄性SD大鼠12只隨機分為兩組，正常對照組(C組，n=6)、MCT模型組(M組，n=6)，M組大鼠按照50mg/kg劑量一次性腹腔注射野百合堿誘導肺動脈高壓模型，C組大鼠一次性腹腔注射與M組等量乙醇生理鹽水混合液；常規喂養20d后行右室插管測定大鼠右室收縮壓(RVSP)，而后采用腹主動脈采血法取血并提取MPs，將提取的MPs刺激大鼠肺動脈，觀察MPs對大鼠肺動脈血管舒張功能的影響。結果：C組來源的MPs對肺動脈血管舒張功能無影響，M組來源的MPs部分抑制肺動脈的舒張功能。結論： 肺動脈高壓大鼠體內的循環MPs通過抑制肺動脈舒張進而加重肺動脈高壓的病情進展。

肺動脈高壓(Pulmonary hypertension, pH)為一類極度嚴重的疾病，嚴重危害患者身心健康。以往研究報道肺動脈高壓大鼠肺動脈血管舒張功能顯著受損[1]。循環微顆粒(Circulating microparticles，MPs)是內皮細胞、白細胞、血小板發生凋亡或受到病理刺激時分泌的微粒，參與炎癥反應、激活凝血系統及侵蝕內皮細胞[2,3]。近期研究還發現MPs通過影響內皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric oxide synthase, eNOS)和彈性蛋白(Elastin)參與肺動脈高壓的發生和發展。我們將通過研究MPs與肺動脈血管舒張功能的關系來進一步探討肺動脈高壓的發病機制。

材料與方法

1 實驗動物 雄性SD大鼠12只，體重200±10g，購自西安交通大學醫學院動物中心。

2 試劑和藥品 野百合堿(Monocrotaline, MCT)、氯化乙酰膽堿(Ach)、重酒石酸去甲腎上腺素(Noradrenaline Bitartrate, NA)、戊巴比妥鈉、L-硝基精氨酸(L-NAME)均購自Sigma公司。K-H液配置：NaCl 118.0 mmol/L、CaCl22.5 m mol/L、KH2PO41.2 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L、glucose 11.0 mmol/L，均為普通國產分析純。

3 儀 器 MD 2000生物信號采集系統購于南京醫科大學，BL-420E生物機能試驗系統購于成都泰盟科技有限公司。

4 pH模型制備及分組 按文獻報道方法制備pH模型[3]：生理鹽水和乙醇(8∶2)混合液將MCT配制成濃度20 g/L的溶液。將12只雄性SD大鼠隨機分為：對照組(C組，n=6)和MCT組(M組，n=6)。M組大鼠以50 mg/kg比例一次性腹腔注射MCT溶液以誘導pH，C組大鼠一次性腹腔注射與M組等量生理鹽水和乙醇(8∶2)混合液，隨后兩組大鼠繼續常規飼養20d。

5 檢 測

5.1 肺動脈壓力的檢測： 飼養20d時，戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，用充滿6250U/L肝素鹽水的硅膠管(外徑0.9mm，內徑0.6mm) 經頸外靜脈置管，一端插入右心室，另一端接壓力換能器并連入BL-420E 生物機能試驗系統記錄右心室收縮壓(Right ventricular systolic pressure，RVSP)[4]以間接反應肺動脈壓力。

5.2 MPs提取及測定 : 按文獻報道用兩步法提取MPs：血液先離心(4℃ 11000g 2min)獲得乏血小板血漿，然后取2ml乏血小板血漿移入1.5ml EP管后再第二次離心(4℃ 13000g 45min)后盡量吸去上清，MPs沉淀于EP管管底，向EP管內加100μl RPMI 1640培養基并吹懸MPs。MPs的蛋白濃度用BCA試劑盒測定后進行下一步實驗(或放-80℃冰箱保存)。

5.3 肺動脈舒張功能檢測：其余6只大鼠，行開胸取肺動脈，立即置于預冷并灌注混合氣(95% CO2混合氣體)的K-H液中，小心剝離動脈周圍結締組織，后將肺動脈橫切為3～4 mm寬的血管環，然后將血管環移入盛有預先通氣、37±0.5℃的K-H液的浴皿中，小心將血管環套在浸泡在浴皿中的張力傳感裝置上，連接MD 2000生物信號采集系統。浴皿中持續通氣，保持恒溫，然后給予2g前負荷并讓血管環平衡60min，期間每間隔15min換1次K-H液。平衡結束后，加入KCl(浴皿濃度10-6mol/L)反復收縮3次，以檢測血管環的穩定性。用K-H液洗脫KCl至基線后進行下列實驗：分別用等量的C組和M組的MPs(1mg/ml)孵育血管環30min后用NA(浴皿濃度10-6mol/L)收縮血管環至最大張力值(Vmax)，然后加入Ach(浴皿濃度10-7～10-4mol/L)并記錄不同Ach濃度的張力值(Vach)，測定舒張百分比：(Vmax-Vach)/Vmax。洗脫各種藥物后用L-NAME (100umol/L)孵育血管環30 min，再次用NA和ACh處理血管環以了解eNOS依賴的血管舒張功能。

結 果

1 RVSP測定 各組大鼠RVSP測量結果，見表1。

表1 各組RVSP (±s)

注：與C組比較，*P<0.05

2 MPs測定 各組大鼠MPs的測量結果，見表2。

表2 各組MPs(±s)

注：與C組比較，*P<0.05

3 血管舒張功能的測定 與C組比較(88.71±1.36)，M組(40.57±3.64)MPs損害了肺動脈血管的舒張功能。L-NAME(eNOS的特異性抑制劑)同樣抑制了Ach舒張血管的功能，提示MPs損害肺動脈血管內皮依賴的舒張功能。pH時，肺血管舒張功能受損可能是通過MPs實現的。

討 論

我國是煙草消費大國，因此慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等慢性肺部疾病發病率明顯高于其他國家；支氣管擴張、肺結核等長期病理刺激最后也會導致pH，并可引起右心衰竭。我們的實驗結果顯示：pH時大鼠體內MPs含量升高，這些升高的MPs損害了內皮依賴的舒張功能，進而繼續加重pH從而形成一個惡性循環的病理生理過程。

MPs是機體在受到高切應力、C 反應蛋白、腫瘤壞死因子等刺激時由血小板、內皮細胞等以出芽方式分泌的亞微米級顆粒，越來越多的研究發現MPs可以反映內皮損傷和內皮功能障礙[5]。Ci等[6]研究還發現MPs可減少內皮細胞eNOS的表達和一氧化氮(NO)的產生。我們最近的研究也發現pH大鼠體內增高的MPs可以減少離體肺血管中eNOS的蛋白表達，增加elastin的表達。本研究顯示： pH大鼠MPs含量升高，而升高的MPs進而損害內皮依賴的離體大鼠肺動脈血管的舒張功能。

肺血管的壓力由肺血管的收縮力和舒張力決定，而血管的收縮和舒張是由內皮分泌的收縮因子和舒張因子之間的相互作用調控的，正常時二者處于穩態。已有研究報道：肺血管的舒張因子主要是由eNOS產生的NO介導的。NO主要通過以下作用影響肺動脈壓力：調節血管緊張度、抑制平滑肌細胞增殖和抑制血小板聚集。此研究發現來源于M組的MPs抑制了肺血管內皮依賴的(由eNOS的特異性抑制劑L-NAME體現)血管舒張功能，肺血管舒張功能的受損必將使肺血管壓力升高而加重pH病情。

綜上所述：pH時大鼠體內的MPs含量升高，這些MPs可以損害肺血管內皮依賴的舒張功能，進而形成了：pH→ MPs →舒張功能受損→ pH加重的惡性循環。進一步闡述了pH的發病機理，為將來尋找pH的防治策略提供了一定的理論基礎。

[1] 王群讓，王旭蘭，代曉霞. 精氨酸防治肺動脈高壓的研究[J]. 陜西醫學雜志，2014，43(9):1115-1117.

[2] Wang JM, Huang Y J, Wang Y,etal. Increased circulating CD31+ / CD42 - microparticles are associated with im paired systemic artery elasticity in healthy subjects[J]. Am J Hypertens, 2007,20(9):957-964.

[3] Hugel B, Carmen M, Martinez MC,etal. Membrane microparticles: two sides of the coin[J]. Physiology，2005，20(1): 22-27.

[4] 常鳳軍，魏 偉，歐志君，等. 左旋精氨酸恢復eNOS和iNOS平衡并抑制肺動脈高壓的研究[J].中華胸心血管外科雜志，2012，28(4):237-240.

[5] 王 妍,陶 軍,楊 震,等. 腫瘤壞死因子促進內皮微顆粒釋放的實驗研究[J]. 中華心血管病雜志, 2005, 33(12): 1137- 1140.

[6] Ci HB, Ou ZJ, Chang FJ ,etal. Endothelial microparticles increase in mitral valve disease and impair mitral valve endothelial function[J]. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism. 2013，304(7):E695-702.

(收稿：2015-03-17)

*陜西省自然科學基金資助(2013JC-16)

肺動脈 血管舒張 @循環微顆粒

R544

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.004

△陜西省人民醫院心血管內二科

#通訊作者