睡眠剝奪對大鼠腦內Aβ表達的影響*

陜西省人民醫院神經內三科(西安710068)

劉 鵬 王 瑾△ 劉 玥 唐 鵬 李 銳▲

睡眠剝奪對大鼠腦內Aβ表達的影響*

陜西省人民醫院神經內三科(西安710068)

劉 鵬 王 瑾△劉 玥 唐 鵬 李 銳▲

目的：觀察睡眠剝奪(SD)后大鼠學習記憶功能及腦內Aβ含量的變化，探討睡眠剝奪導致認知功能減退的機制。方法： 健康Sprague-Dawley大鼠32只隨機平均分為4組，對照3d組(Control-3)，睡眠剝奪3d組(SD-3)，對照9d組(Control -9)，睡眠剝奪9d組(SD-9)。對照組自由食水，良好睡眠；睡眠剝奪組建立睡眠剝奪模型。各組在觀察時間點進行Morris水迷宮評價學習記憶功能之后，斷頭取腦，用免疫組織化學染色方法觀察海馬區Aβ的表達情況。結果：①與對照3d組相比，對照9d組逃逸潛伏期及目標象限時間變化均不大(P>0.05)，但SD 3d組逃逸潛伏期延長，目標象限時間縮短(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期明顯延長，目標象限時間明顯縮短(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期延長，目標象限時間縮短(P<0.05)。②與對照3d組相比，對照9d組海馬區Aβ表達變化不大(P>0.05)，但SD 3d組海馬區Aβ表達增多(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組海馬區Aβ表達明顯增多(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組海馬區Aβ表達增多(P<0.05)。結論： 睡眠剝奪可導致大鼠學習及空間記憶功能減退，且具有時間依賴性，其機制可能與睡眠剝奪可增加腦內海馬區Aβ含量有關。

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經系統慢性退行性疾病，為癡呆最常見的原因，約占全部癡呆的50%～60%左右[1]，其病理特征之一為腦內出現大量老年斑，核心成份是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)。現已證實，Aβ沉積是AD最早的病理改變和發病的關鍵環節[2]。研究表明，睡眠剝奪(Sleep deprivation,SD)可導致記憶力下降，影響認知功能，與AD的發病有一定關系[3]。本文通過復制SD大鼠模型，觀察不同時間長短的SD對大鼠的學習和記憶功能的影響，同時觀察其腦內海馬區Aβ的表達，進一步明確SD與AD的關系。

材料與方法

1 實驗動物與分組 健康SD大鼠32只，5～7月齡，體重180±20g，雌雄不拘，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。隨機平均分為4組，對照3d組(Control-3)，睡眠剝奪3d組(SD-3)，對照9d組(Control -9)，睡眠剝奪9d組(SD-9)。自由進食，食標準顆粒飼料，飲自來水。

2 動物模型制作及實驗流程 使用改良多平臺睡眠剝奪法(MMPM)[4]對大鼠進行睡眠剝奪，每日僅允許睡眠2h，睡眠剝奪期間室內40W白熾燈照明，睡眠期間保持室內黑暗，整個過程避免噪音。

實驗前，每亞組8只大鼠同籠飼養，每天于多平臺上適應2h，共2周，之后再開始正式實驗。根據觀察時間不同，睡眠剝奪分別進行3d、9d，對照組置于大平臺，自由食水，良好睡眠。

每只大鼠在觀察時間點處死前行Morris水迷宮認知功能測評，然后斷頭取腦，做腦組織切片免疫組織化學染色，觀察大腦海馬區的Aβ表達情況。

3 材料與試劑 兔抗大鼠Aβ、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、正常山羊血清均由武漢博士德公司提供；通用Morris水迷宮，上海吉量科技公司。

4 Morris水迷宮實驗 大鼠熟悉環境l周，然后嚴格按文獻記載進行定位航行實驗和空間探索實驗。由視頻監視探頭記錄實驗過程，每只大鼠在同一平臺上游泳，記錄動物找到平臺逃逸的潛伏期，游泳總路程及游泳速度，共測試3次記錄其平均值。允許其在120s內找到平臺，找到后在平臺上保持20s。若在120s內找不到平臺，則將大鼠引導至平臺上保持20s，并將潛伏時記錄為120s。

5 腦組織切片的制作 麻醉后用0.9%氯化鈉溶液和多聚甲醛進行心臟灌注固定，斷頭取腦。在大腦半球距嗅球尖端7～11mm之間冠狀切取約5mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成臘塊，連續切片，片厚5μm。每只動物連續取3張切片,用于免疫組化染色。

6 腦組織Aβ免疫組化染色觀察 取各組大鼠腦切片行Aβ免疫組化染色。應用圖像信號采集與分析系統，光鏡下隨機計數大腦海馬區各5個不重疊視野(×40)下Aβ陽性斑塊個數求均數。

結 果

1 睡眠剝奪對大鼠學習及空間記憶能力的影響 見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗潛伏期和目標象限時間的比較(±s)

注：與Control-3比較*P<0.05;與Control-3比較#P>0.05;與Control-9比較△P<0.01;與SD-3比較△P<0.05

與對照3d組相比，對照9d組逃逸潛伏期及目標象限時間變化均不大(P>0.05)，但SD 3d組逃逸潛伏期延長，目標象限時間縮短(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期明顯延長，目標象限時間明顯縮短(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期延長，目標象限時間縮短(P<0.05)

2 睡眠剝奪對大鼠腦海馬區Aβ表達的影響 見表2。

表2 各組大鼠腦海馬區Aβ斑塊數的比較(±s)

注：與Control-3比較*P<0.05;與Control-3比較#P>0.05;與Control-9比較△P<0.01;與SD-3比較△P<0.05

與對照3d組相比，對照9d組海馬區Aβ斑塊數變化不大(P>0.05)，但SD 3d組海馬區Aβ斑塊數增多(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組海馬區Aβ斑塊數明顯增多(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組海馬區Aβ斑塊數增多(P<0.05)。

討 論

本研究發現，睡眠剝奪(SD)可影響大鼠學習能力及空間記憶功能，且隨睡眠剝奪時間延長而影響加大。同時，睡眠剝奪能增加大鼠腦內海馬區淀粉樣蛋白β(Aβ)的表達，同樣存在時間依賴性。因此，我們認為睡眠剝奪與阿爾茨海默病的發生有密切關系。

AD為最常見的癡呆病因，嚴重危害人類健康，但其病因和發病機制還不完全清楚。在病理學上，AD以腦內出現大量老年斑和神經原纖維纏結為特征。其中老年斑的核心成份是Aβ。現已證實，Aβ沉積是AD最早的病理改變和發病的關鍵環節[2]，Aβ是淀粉樣蛋白前體(APP)經過β分泌酶及γ分泌酶切割后的產物，由40(Aβ-40)或42～43(Aβ-42，43)個氨基酸組成的蛋白質。

有研究表明，睡眠障礙與AD發生發展有密切關系[5，6]。Brendan等發現，腦內Aβ濃度存在明確的晝夜波動，正常睡醒周期下，覺醒時腦內Aβ濃度增多，睡眠時Aβ濃度減少。可能與覺醒時神經元活動增多，產生Aβ增多超過了大腦對其的清除，睡眠時神經元活動減少，Aβ產生較少而清除增多所致。本研究發現，睡眠剝奪不但影響大鼠的學習能力和空間記憶能力，而且可增加大鼠腦內海馬區Aβ的表達，且均有時間依賴性，有良好的一致性。說明睡眠剝奪可以增加腦內Aβ的表達，進一步促進AD的發生發展。但目前對睡眠障礙導致AD的具體機制尚不清楚，可能與下列學說有關：①神經元活性學說：研究表明，覺醒時間過長時神經元活性增強，活性增強的神經元可導致更多的Aβ沉積，睡眠時則相反；②應激反應學說：睡眠障礙是一種典型的應激源，可產生三種應激反應，即神經體液反應、氧化應激反應和內質網應激反應。研究表明，睡眠剝奪作為一種應激源，同其他應激形式如孤養，噪音干擾，氣味干擾，強迫游泳等一樣均可增加腦內Aβ沉積。③褪黑素學說：睡眠剝奪可使腦內褪黑素減少，而褪黑素有減少Aβ的生成，聚集及沉積，并可保護神經元免受Aβ的損害等作用，故睡眠剝奪可通過減少褪黑素影響AD的發生。

綜上所述，本研究證實了睡眠剝奪可影響大鼠學習記憶功能，且具有時間依賴性，其機制可能是增加大鼠腦內海馬區Aβ的沉積所致。

[1] Blennow K,De LM,Zetterberg H.Alzheimer'sdisease[J].Lancet,2006,368(9522):387-403.

[2] Henry W. Querfurth, Alzheimer’s Disease[J]. N Engl J Med,2010,362:329-344.

[3] Yo-El S J,Jennifer S. Sleep quality and preclinical Alzheimer Disease[J].JAMA Neurol,2013,70(5): 587-593.

[4] Zhang L,Zhao ZX.0bjectjve and subjective measures for sleep disorders[J].Neurosci Bull,2007,23:236-240.

[5] Antonio DM,Yash BJ,Domenico P. Sleep deprivation impairs memory, tau metabolism , and synaptic integrity of a mouse model of Alzheimer’ s disease with plaques and tangles[J].Neurobiology of Aging, 2014,35(8):1813-1820.

[6] Jae-Eun K,Miranda ML,Randall J.Bateman.Amyloid-βare regulated by orexin and the sleep-wake cycle[J].Science,2009,326(5955):1005-1007.

(收稿：2014-10-30)

*陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2013JM4020)

睡眠剝奪 學習障礙 記憶障礙 淀粉樣β蛋白 動物，實驗 大鼠

R742

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.003

△西安交通大學醫學院第一附屬醫院神經內科

▲通訊作者