神經肽B在中樞神經系統中的免疫熒光表達

郁阿翠 黃俊山 曾雪愛

·基礎研究·

神經肽B在中樞神經系統中的免疫熒光表達

郁阿翠 黃俊山 曾雪愛

目的 研究神經肽B(NPB)在大鼠腦組織中的定位，探討NPB與睡眠的關系。方法 采用免疫熒光法測定NPB在除嗅球、垂體及小腦以外大鼠腦組織中的表達。結果及結論 NPB不僅表達于于下丘腦腹內側核、背內側核、弓狀核、視交叉上核和未定帶腹側區及中腦的腹側被蓋區，中縫背核，黑質等區域，還見于基底前腦的VDB和HDB；內、外側蒼白球，尾狀核；丘腦網狀核；腦干的中縫隱核、中縫核、前被蓋核、橫紋肌核、旁正中網狀核、巨細胞網狀核。

神經肽B；免疫熒光；腦立體定位

神經肽B(NPB)是2002年Fuji等[1]從牛的下丘腦中提取鑒定出來的G蛋白耦合受體7(GPR7)和G-蛋白耦合受體8(GPR8)的內源性配體，NPB及其受體在中樞神經系統及外周組織均有廣泛存在，參與調節了攝食和能量平衡、神經內分泌及炎性反應疼痛，近年還發現其參與了睡眠與應激情緒和行為的調節。功能與組織分布具有密切的關系。為了更深入的研究NPB與睡眠的關系，本文通過免疫熒光測定了除嗅球、垂體及小腦以外的大鼠腦連續切片，發現NPB陽性細胞不僅存在于下丘腦腹內側核、背內側核、弓狀核、視交叉上核和未定帶腹側區[2-3]及中腦的腹側被蓋區，中縫背核，黑質等區域[3]，還見于基底前腦的VDB和HDB；內、外側蒼白球，尾狀核；丘腦網狀核；腦干的中縫核、中縫隱核、前被蓋核、橫紋肌核、正中網狀核、巨細胞網狀核。為進一步研究NPB與睡眠的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6只SD雄性大鼠，體重220～250 g，購自福建醫科大學實驗動物中心[實驗動物許可證號SCXK(閩)2012-0001]。

1.2 設備及試劑 冰凍切片機(CMl900，Leica)；熒光倒置相差顯微鏡(DMI3000，Leica)；-20 ℃冰箱(伊萊克斯，型號BCD-182K)；Neuropeptide B Antibodies(Pierce Biotechnology公司)；Alexa Fluor@488標記山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈，北京中杉金橋生物技術有限公司)；10%正常羊封閉血清(福州碩博生物技術有限公司)，免疫熒光染色二抗稀釋液(碧云天生物技)；抗熒光淬滅封片液(強，碧云天生物技術公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本處理 實驗大鼠經10%水合氯醛按0.3 mL/100 mg麻醉后迅速開胸，先使用200 mL 0.1 mol/L PBS溶液從主動脈灌流，后采用4 ℃的4%多聚甲醛先快后慢外固定。冰上迅速分離腦后，置于4%多聚甲醛過夜，然后移至30%蔗糖溶液中脫水。等組織沉底后，在液氮中速凍1 min，利用冰凍切片機切片，30 μm/片，收集切片到凍存液中備用。

1.3.2 NPB免疫熒光染色 將組織切片從凍存液中取出放入12孔板孔中，用0.01 PBS磷酸鹽緩沖液洗5遍，每次10 min；10%正常羊封閉血清37 ℃封閉90 min；NPB抗體(1∶500)，4 ℃孵育48 h后用0.01PBS磷酸鹽緩沖液洗5遍，每次10 min；Alexa Fluor@488標記山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈，1∶200)孵育2 h；0.01PBS磷酸鹽緩沖液洗5遍，每次10 min；DAPI染色液常溫染色5 min，0.01PBS磷酸鹽緩沖液洗3遍，每次5 min；將組織切片轉移到載玻片上用抗熒光淬滅封片液(強)封片，倒置熒光顯微鏡下拍片。以上3個步驟注意避光。

圖像采集使用DMI3000，Leica的熒光倒置相差顯微鏡，參考腦立體定向圖譜(Paxinos和Watson)分析單側神經核團從腹側向背側的所有陽性神經元表達分布情況。

2 NPB陽性細胞在大鼠腦組織中分布

2.1 基底前腦 NPB陽性細胞在基底前腦斜角帶水平支臂核(HDB)和斜角帶垂直支臂核(VDB)的分布，見圖1A-B。

圖1 NPB陽性細胞在基底前腦的分布

注：A、NPB陽性細胞在基底前腦斜角帶水平支臂核(HDB)的分布。B、NPB陽性細胞在基底前腦斜角帶垂直支臂核(VDB)的分布。

2.2 蒼白球及其附近組織 NPB陽性細胞在內外側蒼白球有中等數量分布，而在其附近的丘腦網狀核(Rt)及下丘腦未定帶區(ZI)有相對更多數量的分布，見圖2 A-B。

圖2 NPB陽性細胞在蒼白球及其附近組織的分布

注：(A)中等數量的NPB陽性細胞存在于外側蒼白球(LGP)。(B)在內側蒼白球(MGP)也有數量較多的NPB陽性細胞存在，但在丘腦網狀核(Rt)和下丘腦未定帶區(ZI)觀察到更多數量。

2.3 下丘腦 NPB陽性細胞在下丘腦多個部位均有存在，如下丘腦外側區(LH)，弓狀核(Arc)(圖3A、D)，未定帶區(ZI)(圖2B)均可見中等數量的NPB免疫陽性細胞。更有大量的NPB陽性細胞存在下丘腦室旁核(PaLM、PaMP)和視上核(SO)，而在下丘腦視周核(Pe)僅有零星分布(圖3B、C)。在正中隆起的內外層(MEE、MEI)也有NPB陽性細胞的分布，見圖3D。

圖3 NPB陽性細胞在下丘腦的分布

注：(A)中等數量的NPB陽性細胞存在于下丘腦外側區(LH)。(B)在下丘腦室旁核(PaLM、PaMP)有數量較多的NPB陽性細胞存在，而在下丘腦視周核(Pe)僅有離散分布。(C)NPB陽性細胞在視上核(SO)的分布。(D)NPB陽性細胞在弓狀核(Arc)及正中隆起的內外層(MEE、MEI)分布，細胞形態較視上核及視旁核的細胞小。

2.4 腦干 實驗發現，NPB陽性細胞不僅見于中腦腹側被蓋區(VTA)、中縫背核(DR)、黑質(SN)及埃-韋斯特法爾核(EW核)，見圖4A-D。在腦干其他部位，也存在NPB陽性細胞，如腦干的中縫正中核(MnR)、中縫旁正中核(PMnR)、中縫隱核(Rob)、腦橋網狀核嘴側部(PnO)、前被蓋核(Atg)、橫紋肌核(Rbd)、旁正中網狀核(PMn)、巨細胞網狀核(Gi)，見圖4E-I。另外，在藍斑(LC)大細胞中也有NPB蛋白的表達，見圖5。

3 討論

已有多項研究證明具有調節能量代謝和內分泌功能的神經肽一般也具有調節睡眠的作用，如食欲肽[4-5]、神經肽S[6-7]、神經肽Y[8]等。2011年Hirashima等[9]在光、暗兩個時相分別給側腦室注射NPB，發現在暗時相NPB減少了小鼠自發活動，腦電及肌電測定也顯示在該時相NPB，增加慢波睡眠(SWS)，而異相睡眠并未受影響，并且NPB誘導的慢波睡眠的光譜功率與生理性的。但是NPB通過何種途徑調節睡眠還不是很清楚。結構和功能是密切相關的，本實驗發現NPB免疫陽性細胞在下丘腦、腦干及基底前腦的多個核團均有表達。

圖4 NPB陽性細胞在腦干的分布

注：(A)NPB陽性細胞在埃-韋斯特法爾核(EW核)的分布。(B)在維管束間核(IF)未見明顯NPB免疫陽性細胞存在，在腹側被蓋區(VTA)及PN核有少量NPB陽性細胞分布。(C)在黑質(SN)，NPB陽性細胞主要分布在黑質背層(SNCD)及黑質內側部(SNM)，在黑質網狀部(SNR)及黑質外側部(SNL)也有分布。(D)NPB陽性細胞在中縫背核(DR)、中縫正中核(MnR)、中縫旁正中核(PMnR)、前被蓋核(Atg)、橫紋肌核(Rbd)的分布。(E)NPB陽性細胞中縫正中核(MnR)、中縫旁正中核(PMnR)的分布。(F)NPB陽性細胞在腦橋網狀核嘴側部(PnO)的離散分布。(G)NPB陽性細胞在中縫隱核(Rob)、旁正中網狀核(PMn)、巨細胞網狀核(Gi)的分布。(H)及(I)顯示高倍鏡下NPB免疫陽性細胞在中縫隱核(Rob)、旁正中網狀核(PMn)、巨細胞網狀核(Gi)的分布。

圖5 NPB陽性細胞在藍斑的分布，其細胞形態多呈紡錘形

覺醒依賴于腦干網狀結構上行激活系統的激活，該系統經中腦分為兩支，一支經過丘腦，另一支經下丘腦外側區和基底前腦到達皮層，研究發現腦干網狀結構-丘腦-皮層通路在覺醒維持中的作用較小，主要是腦干網狀結構-下丘腦外側區和基底前腦-皮層發揮作用[10]。NPB在網狀核的分布提示其是腦干網狀結構的組成部分，另外其在下丘腦、基底前腦的分布，提示可能參與腦干網狀結構上行激活系統的調節，在以后的實驗中可以通過局部注射NPB或是其激動劑、抑制劑，再通過神經束路示蹤技術觀察NPB的神經傳導通路，另外還可以通過腦電、肌電觀察判斷這些核團中的NPB對睡眠的具體影響。研究發現在中腦的腹側被蓋區(VTA)，黑質(SN)區均有NPB陽性細胞存在，且與酪氨酸羥化酶陽性神經元(可能為多巴胺能神經元)共表達[11]。研究表明酪氨酸羥化酶和食欲素受體在VTA廣泛共表達[12]。那么在中腦，NPB是否與食欲素受體有直接的聯系，這種假設還有待進一步的研究證實。

慢性睡眠剝奪作為一個應激源可激活HPA軸[13-14]，研究發現慢性睡眠剝奪會導致肥胖的發生，可能的方式是通過增加攝食，降低基礎代謝率及增加胰島素抵抗等[15]。NPB具有調節下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)皮質軸的作用[16]，同時還可增加抵抗素的分泌和表達[17]。下丘腦外側區被稱為“攝食中樞”，損毀或者高頻電刺激該區均可以減少食物的攝取致體重的下降[18]。本實驗發現NPB在下丘腦外側區的分布，提示其可能與慢性睡眠剝奪后的能量調控有關。

睡眠剝奪常伴發情緒障礙，如焦慮、緊張、易怒[19]，中縫核是5-HT能神經元的密集區，具有調節情緒、壓力及協調社會關系的作用，NPB在中縫背核，中縫隱核、中縫核的分布提示其可能參與睡眠障礙伴發的情緒障礙的發生及發展。

目前關于NPB在睡眠中的研究還較少，其在睡眠調控區域的廣泛分布預示著其可能參與睡眠調節的多個過程，加深對NPB在睡眠調控中的認識，有助于為深入研究機體對睡眠與覺醒的調節機制尋找一個切入點。

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Neuropeptide B immunofluorescence in the central nervous system of the rat

YU Acui, HUANG Junshan, ZENG Xueai.

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003,China

Objective To study the expression of NPB in the rat brain,in order to further research the relationship between NPB and sleep.Methods With the use of an antiserum directed against the rat NPB, immunofluorescence to NPB was detected in several discrete areas of the central nervous system except the olfactory bulb,pituitary and cerebellum of serial section in this article.Results & Conclusion I found that NPB immune positive (irNPB) cells not only prenst in the hypothalamic (ventromedial nucleus, dorsal medial nucleus), arcuate hypothalamic nucleus,supraoptic nucleus and zona incerta, The ventral tegmental area, dorsal raphe nucleus, substantia nigra and so on of the midbrain , they also were found in the basal forebrain (VDB and HDB), globus pallidus(lateral,medial), caudate putamen (striatum), reticular thalamic nucleus, median raphe nucleus, raphe obscurus nucleus, anterior tegmental nucleus, rhabdoid nucleus, paramedian reticular nucleus and gigantocellular reticular nucleus.

Neuropeptide B; G-protein coupled receptors; Sleep; Stress

國家自然科學基金項目(編號：81173149，81202845)；福建省中醫藥研究院自主選題項目(編號：2013fjzyyk-1)

350003福州，福建省中醫藥研究院

黃俊山，E-mail：hjsh0825@163.com