山東地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒抗原相關(guān)性和血清分型

胡北俠，許傳田，楊少華，黃艷艷，張 琳，黃慶華，霍亞飛，張 偉，張秀美*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018)

山東地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒抗原相關(guān)性和血清分型

胡北俠1，許傳田1，楊少華1，黃艷艷1，張 琳1，黃慶華1，霍亞飛2，張 偉1，張秀美1*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018)

為進一步明確山東地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的流行病學，對IBV分離株之間以及與疫苗株之間的抗原相關(guān)性進行了分析。分別制備了3個疫苗株(4/91、H120和Ma5)和18個分離株的單因子陽性血清，通過雞胚交叉中和試驗測定了陽性血清對同源病毒和異源病毒的中和效價，計算了不同毒株之間的抗原相關(guān)系數(shù)(R值)，并根據(jù)R值進行血清分型。結(jié)果顯示，3個疫苗株和18個分離株可分為5個血清型。疫苗株4/91屬于血清Ⅰ型，H120、Ma5與2個分離株(SDWF0608和SDLY0701)屬于同一血清型，分離株SDZB0808與SDLY0702、CK/CH/SD08/007和CK/CH/SD09/001等15個毒株為同一血清型，CK/CH/SD09/006和CK/CH/SD10/001分別與其他3和6個分離株組成兩個血清型。進一步分析發(fā)現(xiàn)，部分IBV毒株之間表現(xiàn)單向中和反應性，屬于同一血清型的IBV毒株之間抗原相關(guān)性可能存在明顯差異。本研究結(jié)果一方面表明IBV毒株之間復雜的抗原相關(guān)性，另一方面顯示IBV流行株與3個疫苗株之間抗原性存在明顯差異。

雞傳染性支氣管炎病毒；交叉中和試驗；抗原相關(guān)性；血清型

雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的一種高度接觸性傳染病，病原是禽傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)。IBV為單股正鏈RNA病毒，很容易通過基因突變、插入、缺失和重組等分子機制產(chǎn)生新的變異株[1-3]。根據(jù)本實驗室前期研究結(jié)果，山東地區(qū)近年來IBV流行株的基因型為QX，同時存在Mass和TC07-2基因型毒株[4-5]。疫苗免疫是預防IBV感染的主要技術(shù)措施之一。目前，包括H120在內(nèi)的多個疫苗株在山東地區(qū)廣泛應用，但免疫雞群仍然不斷發(fā)生IBV的感染，提示IBV疫苗株與流行株之間可能存在明顯的抗原性差異。因此，本研究通過交叉中和試驗對IBV流行株的抗原性進行分析，以明確IBV流行株之間以及流行株與疫苗株之間的抗原相關(guān)性，以進一步豐富IBV的流行病學信息并為此病的有效防控提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)疫苗株H120購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，4/91和Ma5購自英特威公司(Nobillis)，由本實驗室鑒定保存。18個IBV流行株均是從山東地區(qū)發(fā)病雞群分離鑒定，相關(guān)背景資料見表1和本實驗室相關(guān)研究報道[4-5]。

1.2 SPF雞胚和SPF雞

SPF雞和9～11日齡SPF雞胚均購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.3 IBV單因子陽性血清的制備

選擇3個IBV常用疫苗株(H120、Ma5和4/91)和18個分離株，參考文獻[6]方法，制備免疫用IBV滅活抗原，分別免疫4～5周齡的SPF雞，在負壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，制備各個IBV毒株的單因子陽性血清。

1.4 雞胚交叉血清中和試驗

根據(jù)文獻[6]、文獻[7]方法，測定3個IBV疫苗株和18個分離株的病毒滴度(EID50)，采用固定病毒稀釋血清的方法(β-微量法)進行雞胚交叉中和試驗。陽性血清進行2倍倍比稀釋，每個稀釋度血清分別與等體積200 EID50的病毒液混勻，室溫作用60 min后接種9～11日齡SPF雞胚，0.2 mL·胚-1，每稀釋度接種5枚，置37 ℃培養(yǎng)至18日齡，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，根據(jù)雞胚死亡及病變進行結(jié)果判定，以能使50%以上雞胚得到保護的血清最高稀釋倍數(shù)為血清的中和效價。首先測定陽性血清對同源病毒的中和效價，然后分別測定陽性血清對其他IBV毒株的中和效價。

1.5 IBV抗原相關(guān)系數(shù)的計算和血清分型

2 結(jié) 果

2.1 IBV病毒滴度(EID50)測定

3個IBV疫苗株H120、Ma5和4/91以及18個IBV分離株病毒滴度測定結(jié)果見表1。

2.2 雞胚交叉血清中和試驗

3個IBV疫苗株和18個分離株單因子陽性血清對同源病毒的中和效價以及它們之間交叉中和試驗結(jié)果見表2。總體而言，大多數(shù)IBV陽性血清對同源病毒的中和效價比對異源病毒的中和效價高。在3個IBV疫苗株之間，4/91不能被H120和Ma5血清中和，H120和Ma5也不能被4/91血清中和，H120和Ma5之間能夠交叉中和。

在18個IBV分離株與3個疫苗株之間，8/18、9/18和11/18的分離株可以分別被4/91、H120和Ma5陽性血清中和。其中3個分離株(CK/CH/SD09/005、CK/CH/SD08/007和SDIB702/2012)可以同時被4/91、H120和Ma5血清不同程度地中和，3個分離株(CK/CH/SD09/006、CK/CH/SD10/003和SDWF0711)可以被4/91和Ma5血清中和，4個分離株(SDWF0608、SDSG0801、SDIB669/2012和SDZB0808)可以被H120和Ma5血清中和。CK/CH/SD10/001和CK/CH/SD10/002僅被4/91血清中和，SDTA06111和SDLY0701僅被H120血清中和，SDLY0702僅被Ma5血清中和。而3個分離株(CK/CH/SD08/006、CK/CH/SD09/001和CK/CH/SD09/003)與這3個疫苗株血清反應均為陰性。

表1 18個IBV分離株和3個疫苗株分離時間、基因型和病毒滴度

Table 1 Year，genotppe and viral titre of eighteen IBV isolates and three vaccine strains

毒株Strain分離時間Year基因型Genotype病毒滴度/(EID50·0.2mL-1)Virustiter(EID50·0.2mL-1)4/91-4/9110-5.5H120-Mass10-5.5Ma5-Mass10-5.2SDTA061112006Mass10-6.1SDWF06082006QX10-5.0SDLY07012007QX10-5.6SDLY07022007QX10-6.2SDWF07112007QX10-5.3SDSG08012008QX10-5.4SDZB08082008QX10-6.0CK/CH/SD08/0062008QX10-5.8CK/CH/SD08/0072008QX10-5.5CK/CH/SD09/0012009QX10-6.0CK/CH/SD09/0022009QX10-5.2CK/CH/SD09/0052009TC07-210-6.2CK/CH/SD09/0062009QX10-6.2CK/CH/SD10/0012010QX10-6.0CK/CH/SD10/0022010QX10-5.3CK/CH/SD10/0032010QX10-5.5SDIB669/20122012QX10-5.3SDIB702/20122012QX10-5.3

-.IBV疫苗株 -.IBV vaccine strain

在18個IBV分離株中， 5個分離株(SDZB0808、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/002和CK/CH/SD10/003)的陽性血清可以中和3個疫苗株和所有分離株，且對大部分異源病毒的中和效價與對同源病毒的中和效價相同。

此外，交叉中和試驗結(jié)果顯示，無論疫苗株與分離株還是各分離株之間，兩個IBV毒株之間經(jīng)常表現(xiàn)單向交叉中和反應。如4/91與SDZB0808之間，SDZB0808與4/91陽性血清反應陰性，但是4/91可以被SDZB0808血清中和。再如分離株CK/CH/SD09/005陽性血清不能中和SDWF0608、CK/CH/SD08/006、CK/CH/SD08/007和SD/CH/SD09/001，但CK/CH/SD09/005可以被這4個毒株的陽性血清中和。

2.3 IBV抗原相關(guān)系數(shù)與血清型分析

表4 18個IBV分離株和3個疫苗株血清分型

Table 4 Serotype of eightteen IBV isolates and three vaccine strains

血清型Serotype參考株Referencestrain抗原相關(guān)系數(shù)Antigenicrelatednessvalues同一血清型的毒株IBVstrainsinthesameserotypeⅠ4/91R≥80%4/91ⅡH120R≥80%H12025%≤R<80%SDWF0608(Ⅱ,Ⅲ),SDLY0701(Ⅱ,Ⅲ),Ma5ⅢSDZB0808R≥80%SDLY0701(Ⅱ,Ⅲ),SDLY0702,CK/CH/SD08/007,CK/CH/SD09/001(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD09/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD10/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),SDIB669/2012,SDIB702/2012(Ⅲ,Ⅴ)25%≤R<80%SDTA06111(Ⅲ,Ⅴ),CK/CH/SD09/005,SDWF0608(Ⅱ,Ⅲ),SDSG0801,CK/CH/SD10/002,CK/CH/SD08/006,SD-WF0711(Ⅲ,Ⅴ)ⅣCK/CH/SD09/00625%≤R<80%CK/CH/SD09/001(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD09/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD10/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ)ⅤCK/CH/SD10/00125%≤R<80%SDTA06111(Ⅲ,Ⅴ),SDWF0711(Ⅲ,Ⅴ),CK/CH/SD09/001(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD09/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD10/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),SDIB702/2012(Ⅲ,Ⅴ)

SDZB0808與SDTA06111、CK/CH/SD09/005和SDWF0608等15個分離株之間抗原相關(guān)系數(shù)為25%～100%，屬于同一血清型(Ⅲ型)。其中8個IBV分離株(SDLY0701、SDLY0702、CK/CH/SD08/007、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/003、SDIB669/2012和SDIB702/2012)與SDZB0808抗原相關(guān)系數(shù)為100%； SDZB0808與另外7個分離株(SDTA06111、SDWF0608、CK/CH/SD09/005、SDSG0801、CK/CH/SD10/002、CK/CH/SD08/006和SDWF0711)抗原相關(guān)系數(shù)為25%～50%，屬于同一血清型的不同亞型。

此外，CK/CH/SD09/006和CK/CH/SD10/001兩個毒株之間相關(guān)系數(shù)為3%，屬于不同血清型。它們與SDZB0808抗原相關(guān)系數(shù)分別為13%和18%，與SDZB0808血清也不同。CK/CH/SD09/006與CK/CH/SD09/001和 CK/CH/SD09/003兩個毒株相關(guān)系數(shù)均為35%，與CK/CH/SD10/003相關(guān)系數(shù)為25%，屬于同一血清型(Ⅳ型)的不同亞型。CK/CH/SD10/001與SDWF0711、SDTA06111、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/003和SDIB702/2012相關(guān)系數(shù)為25%～70%，屬于同一血清型(Ⅴ型)的不同亞型。不過需要指出的是，CK/CH/SD09/006、CK/CH/SD10/001與SDZB0808的抗原相關(guān)性分別為13%和18%，SDZB0808陽性血清對CK/CH/SD09/006、CK/CH/SD10/001兩個毒株的中和效價均與同源效價相同，如果按照J.B.Brooksby血清型劃分標準(R<10%為不同血清型)或IBV單向交叉中和試驗結(jié)果進行血清分型[6-7，11]，這兩個毒株也可以與SDZB0808劃入同一血清型。

值得注意的是，同一個IBV可能同時屬于多個血清型，如SDWF0608、SDLY0701同時屬于以H120和SDZB0808為參考株的Ⅱ型和Ⅲ型，此外還有SDTA06111(Ⅲ，Ⅴ)、SDWF0711(Ⅲ，Ⅴ)和SDIB702/2012(Ⅲ，Ⅴ)等。另一方面，屬于同一血清型的IBV之間抗原相關(guān)系數(shù)也可能差別較大，如與SDZB0808抗原相關(guān)系數(shù)均為100%的8個毒株之間(表5)，SDLY0701與SDLY0702和SDIB702/2012抗原相關(guān)系數(shù)分別為13%和35%，但與其他5個毒株之間抗原相關(guān)性為0；而CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/003和SDIB669/2012等4個毒株之間抗原相關(guān)系數(shù)均為100%。與此類似，同屬于Ⅱ型的SDWF0608與Ma5抗原相關(guān)系數(shù)均為25%，但SDLY0701與Ma5之間相關(guān)系數(shù)為0。

基于S1基因序列的基因分型與血清分型結(jié)果不一致。如Mass基因型分離株SDTA06111與H120、Ma5抗原相關(guān)性分別為13%和0，屬于不同的血清型；而與QX基因型分離株SDLY0612、SDZB0808、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD10/001和CK/CH/SD10/002的抗原相關(guān)性為25%～70%， 屬于同一血清型的不同亞型。TC07-2基因型分離株CK/CH/SD09/005與QX基因型分離株SDLY0612、SDZB0808和SDIB702/2012之間抗原相關(guān)系數(shù)為35%～50%，屬于同一血清型的不同亞型。

表5 與SDZB0808抗原相關(guān)系數(shù)100%的8個毒株之間抗原相關(guān)系數(shù)

Table 5 Antigenic relatedness values of 8 IBV isolates showingRvalues of 100% with SDZB0808

%

3 討 論

3個疫苗株之間交叉中和試驗結(jié)果顯示，4/91與H120/Ma5之間不能交叉中和，抗原相關(guān)系數(shù)均為0，說明4/91與H120/Ma5之間沒有共同的中和性抗原表位，但是3/18的IBV分離株(CK/CH/SD09/005、CK/CH/SD08/007和SDIB702/2012等)可以同時被4/91、H120和Ma5陽性血清中和，表明這些IBV分離株同時具有4/91、H120和Ma5部分中和性抗原表位。其中5個分離株(SDZB0808、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD09/002和CK/CH/SD10/003)陽性血清可以中和3個疫苗株和所有分離株，且對大部分異源病毒的中和效價與同源效價相同，表明這5個毒株的抗原譜較廣，能夠誘導交叉中和反應抗體。

部分IBV毒株之間一方面表現(xiàn)單向交叉中和反應，另一方面屬于同一血清型的IBV毒株之間抗原相關(guān)性可能存在明顯差異，表明IBV抗原的復雜性。這些特性也見于之前的相關(guān)研究，S.P.Mondal等研究發(fā)現(xiàn)IBV分離株 CU82805與DE072之間S1基因核苷酸相似性為96%， CU82805陽性血清可以中和DE072，但是CU82805不能被DE072陽性血清中和[10]。其他學者在對IBV進行血清分型時也發(fā)現(xiàn)了IBV毒株之間復雜的抗原關(guān)系。B.S.Cowen等通過單向雞胚交叉中和試驗對12株IBV進行分型時發(fā)現(xiàn)屬于同一血清型的不同毒株之間抗原相關(guān)性存在差異[12]。R.W.Winterfield等發(fā)現(xiàn)同一血清型的不同毒株與其他血清型毒株之間的抗原相關(guān)性存在明顯差異[13]。

雖然IBV中和性抗原表位位于S1蛋白上，但是基于抗原相關(guān)系數(shù)的IBV血清分型與S1基因分型結(jié)果并不一致。如SDTA06111和疫苗株H120、Ma5S1基因處于同一進化分支(Mass基因型)，但是SDTA06111與H120、Ma5屬于不同血清型，而與QX基因型SDZB0808屬于相同血清型的不同亞型。再如CK/CH/SD09/005屬于TC07-2基因型，但與QX基因型毒株SDZB0808抗原相關(guān)性為50%，屬于同一血清型的不同亞型。M.Li等采用雞胚氣管環(huán)單向交叉中和試驗將廣西26個IBV分離株和3個疫苗(4/91、H120和Ma5)分成7個血清型，同時對其S1基因高變區(qū)(HVR1)進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示血清分型與基因分型結(jié)果符合率僅為57.7%[6]。IBV血清分型與S1基因分型結(jié)果不一致的原因可能在于：(1)S1蛋白上個別氨基酸的突變可能導致中和性抗原表位的改變，從而導致血清型的改變[14]；(2)雖然IBV中和性抗原表位主要存在于S1蛋白上，但其S2蛋白上也存在中和性抗原表位[15]。S1基因分型和血清分型分別反映了IBV在基因序列和抗原決定簇方面的差異，二者分類方法不同，其不一致性是可以理解的，類似的現(xiàn)象也見于人乙型肝炎病毒[16]。但C.H.Wang等對9個臺灣分離株通過雞胚交叉中和試驗進行血清分型結(jié)果與S1基因分型結(jié)果一致[7]，原因可能在于毒株的數(shù)量有限。

目前，IBV中和試驗采用的培養(yǎng)系統(tǒng)有雞胚腎細胞空斑減少試驗、雞胚氣管環(huán)和雞胚中和試驗。由于大多數(shù)IBV分離株在雞胚腎細胞上不能產(chǎn)生明顯的病變，多數(shù)學者采用雞胚氣管環(huán)或雞胚中和試驗進行IBV抗原性分析。在進行IBV血清分型時尚沒有統(tǒng)一的參考標準。對于單向交叉中和試驗，B.S.Cowen等認為如果32～320 EID50/TCID50的IBV毒株A能被20單位的毒株B陽性血清中和，就認為這兩個毒株是一個血清型[12]，而M.Li等認為100 TOC-ID50的IBV毒株A被毒株B陽性血清中和的效價達到毒株B的同源效價，就認為這兩個毒株血清型相同[6]。對于雙向交叉中和試驗，有的學者認為兩個毒株抗原相關(guān)系數(shù)(R值)小于5%為不同血清型[7]，有的學者認為R值小于10%為不同血清型[11]，本研究采用雙向雞胚交叉中和試驗，參考楊漢春的方法，采用R小于25%為不同血清型的劃分標準[9]。由于同一血清型IBV毒株之間可能存在抗原性差異以及不同血清型毒株之間的抗原交叉性，雙向交叉中和試驗更有助于明確毒株之間的抗原相關(guān)性。另一方面，由于各個實驗室進行血清分型采用的參考株不同，導致彼此的研究結(jié)果沒有可比性，大大限制了血清分型在IBV流行病學研究中的應用。因此，有必要建立用于IBV流行株血清分型的標準參考株和陽性血清，使IBV的血清分型結(jié)果具有更為廣泛的流行病學意義和參考價值。

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(編輯 白永平)

Antigenic Relatedness and Serotype of Infectious Bronchitis Virus Isolated in Shandong Province

HU Bei-xia1，XU Chuan-tian1，YANG Shao-hua1，HUANG Yan-yan1，ZHANG Lin1，HUANG Qing-hua1，HUO Ya-fei2，ZHANG Wei1，ZHANG Xiu-mei1*

(1.ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding，InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China；2.CollegeofAnimalScience，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

To clarify the epidemiology of infectious bronchitis virus (IBV) in Shandong province，the antigenic difference among field isolates and vaccine strains was studied.The monovalent antisera against 3 commercial IBV vaccine strains (H120，Ma5 and 4/91) and 18 field isolates were prepared in SPF chickens.The cross viral neutralization (VN) test was performed in SPF chicken embryos to determine the endpoint titers for homologous and heterologous neutralization.The serotype of IBV strains was determined based on antigenic relatedness values (ARV) calculated by the formulaR=r1×r2.As a result，vaccine strain 4/91 was belong to serotype I.Vaccine strain H120，Ma5 and two isolates (SDWF0608 and SDLY0701)were grouped in the same serotype.SDZB0808 and the other 15 isolates were grouped in the same serotype.CK/CH/SD09/006 and CK/CH/SD10/001 were in 2 other different serotypes，together with other 3 or 6 IBV isolates，respectively.Moreover，some IBV strains showed one-way neutralizing reaction with others and some IBV strains in the same serotype had different ARVs.The resultes indicate that the antigenicity of IBV strains is very complicated and there are evident antigenic difference between IBV isolates and 3 vaccine strains.

infectious bronchitis virus；cross neutralization test；antigenic relatedness value；serotype

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.015

2014-08-21

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金(CARS-42-Z12)

胡北俠(1974-)，女，江蘇東海人，博士，副研究員，主要從事禽病綜合防控技術(shù)研究，Tel:0531-88970857，E-mail：hubeixia917@sina.com

*通信作者：張秀美(1956-)，女，江蘇徐州人，研究員，主要從事禽病綜合防控技術(shù)研究，E-mail：zxm820410@163.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)04-0615-09