表達譜芯片篩選獺兔毛色相關候選差異表達基因

施麗娟，秦立志，王文洲，閆曉榮，翁巧琴，吳信生*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2.江蘇省動物繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009；3.浙江省余姚市欣農兔業有限公司，余姚 315400)

表達譜芯片篩選獺兔毛色相關候選差異表達基因

施麗娟1，2，秦立志1，2，王文洲1，2，閆曉榮1，2，翁巧琴3，吳信生1，2*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2.江蘇省動物繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009；3.浙江省余姚市欣農兔業有限公司，余姚 315400)

本研究旨在了解青紫藍色獺兔和白色獺兔毛色形成的分子遺傳學機理。試驗分為3組，每組包含全同胞青紫藍獺兔和白色獺兔各1只。利用安捷倫基因芯片技術分析不同分組之間差異基因表達情況，并通過實時熒光定量PCR方法對部分差異顯著基因進行驗證。差異表達分析結果顯示，3組青紫藍色獺兔對白色獺兔分別篩選出545、1 680和2 092個差異表達基因 (Differentially expressed genes，DEGs)，共有172個共同基因；GO(Gene Ontology)分類結果顯示，這些基因主要參與細胞分化、增殖、凋亡、發育、離子轉運、免疫應答等生物學過程。通過實時熒光定量PCR技術對Creb1、Wnt2、Gnaq和Gna14基因在組織樣中的表達量進行檢測，結果與表達譜芯片一致。通過表達譜芯片結果結合生物信息學分析和文獻報道，篩選出了Creb1、TH、Wnt2、Gnaq、Dvl1、Mapk12等對毛色形成可能具有重要影響的候選基因。

獺兔；毛色；差異表達基因；基因芯片

獺兔的毛皮柔軟美觀、輕便保暖，一直以來都備受人們的喜愛，特別是其自然形成的多種多樣的毛色，更能滿足不同消費者的審美需求。培育多色獺兔既可以增加獺兔的特色附加價值，也可以提高養兔業的經濟效益。在獺兔的選育工作中，一般通過雜交方法，組合不同的基因型，培育出多種色型的獺兔。青紫藍獺兔是獺兔的一個品種，全身被毛基部為瓦藍色，中段為珍珠灰色，毛尖部為黑色。頸部毛色略淺于體側部，背部毛色較深，腹部毛色呈淺藍或白色。因為其被毛類似于青紫藍兔，故得名。毛色遺傳作為可以利用的遺傳標記，在人、鼠、豬等多種哺乳動物中都有研究[1-2]。哺乳動物的毛色是遺傳基礎復雜的質量性狀，而后天的環境也會對毛色有一定的調控作用[3]。D.C.Bennett等[4]研究表明，小鼠體內控制毛色形成的多個通路中包含大約127個基因。哺乳動物的皮毛之所以出現從白到黑的多種顏色，主要是由體內黑色素細胞產生的真黑素和棕黑素之間的相對數量與分布決定的[5-6]。高文玉[7]通過對獺兔毛色遺傳資料的收集整理，發現影響獺兔毛色的基因至少涉及10個系統或座位，其可通過等位基因和不同位點基因間的相互作用決定獺兔毛色的具體表達。許多研究已證實，Mc1r、Mitf、Kit、Asip、Mlph、Pmel-17等基因參與了黑色素的產生，并與哺乳動物毛色的形成過程相關[8-13]。

自1991年基因芯片概念被首次提出開始[14]，基因芯片技術因其自動化、高通量、微型化檢測等優點，迅速成為生命科學界的研究熱點[15]，隨著各種相關技術的發展，基因芯片已成為“后基因組時代”基因功能分析研究的最重要技術之一。基因芯片技術是一項由分子生物學、微電子學、物理學、化學和計算機學等多學科交叉融合而成的高新技術，高通量篩選的特點使其在基因表達分析、疾病診斷和治療、新藥發現等眾多領域得到廣泛應用[16]。本研究利用家兔全基因表達譜芯片技術篩選青紫藍色獺兔和白色獺兔背部皮膚組織差異表達基因，探索對毛色形成可能具有重要影響的功能基因，初步揭示相關基因的差異表達模式，為進一步篩選調控獺兔體內黑色素生成、多種多樣毛色形成相關的主效基因以及毛色的進一步選育改良工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選取14日齡青紫藍色和白色獺兔各3只(由浙江省余姚市欣農兔業有限公司提供)，來自于3對獺兔全同胞個體，其中每對全同胞個體均含有青紫藍色獺兔和白色獺兔各1只。取背中部靠近脊椎處約 1.5 cm2皮膚樣，剪去表層毛發后將其剪成小塊放入去 RNA 酶指形管，于液氮中保存備用。

1.2 基因芯片

本試驗采用Agilent 兔全基因組4*44K 芯片(design ID：020908)，購自上海伯豪生物芯片有限公司。

1.3 RNA提取和純化

采用Trizol法提取樣品的總RNA，所得總RNA 經Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies，US)電泳質檢合格，并使用RNeasy mini kit(QIAGEN，Germany)和RNase-Free DNase Set(QIAGEN，Germany)純化總RNA。

1.4 熒光標記

采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒提取試驗樣品總RNA，按照Low Input Quick Amp Labeling Kit、One-Color(Agilent technologies，US)的要求，對樣品總RNA中的mRNA進行放大和熒光標記，并用RNeasy mini kit(QIAGEN，Germany)對標記后的cRNA進行純化。

1.5 芯片雜交

按照Agilent表達譜芯片所提供的雜交標準流程和配套試劑盒，將1.65 μg的cRNA樣在65℃滾動雜交爐中10 r·min-1滾動雜交17 h，并在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit(Agilent technologies，US)。

1.6 芯片的洗滌及掃描

從雜交爐中取出已經完成雜交的芯片，用 GE Wash Buffer 洗滌芯片，并用 Agilent Microarray Scanner 進行掃描。用 Feature Extraction software 10.7 讀取數據，最后采用 Gene Spring Software 11.0 進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.7 數據分析

將讀取的數據進行歸一化處理后，以 Ratio≥2 或Ratio≤0.5 篩選差異表達基因。對于篩選出的未知基因，根據其登錄號在 NCBI 上搜索其功能注釋。

1.8 熒光定量PCR驗證

利用與芯片同一批組織樣提取RNA進行熒光定量PCR驗證，隨機選取3個芯片結果中的差異表達基因，以GAPDH作為內參基因，采用 SYBR GreenⅠ法進行熒光定量試驗，以驗證芯片結果的可靠性，預混體系UltraSYBR Mixture (With ROX) 購自北京康為世紀生物科技有限公司。引物利用Oligo7軟件根據芯片探針相對應的核酸序列設計(表1)。采用TaKaRa 公司的 PrimeSYB?Perfect Real Time 試劑盒制備cDNA，標準曲線由 cDNA 梯度稀釋后建立。每個樣品設置3個重復，利用ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，US)分析PCR過程中的熒光信號值，并獲得各樣品和基因的Ct值，以2-ΔΔCt方法計算基因表達的差異倍數。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

基因名稱Genename引物序列(5'→3')Primersequence片段大小/bpThefragmentlengthGAPDHF:CGGCACGAAGCTGGTGAAAGA R:GCGATCCAGGAAGGTGAGGAAGT293Wnt2F:ACTTCAGGAAAACGGGCGAT R:CTGCCTCTCGGTCCCTGATA115Creb1F:AGACTTCAGCACCTGCCATC R:TGTCCATCAGTGGTCTGTGC140GnaqF:AGGCTCATGCACAATTAGTTCG R:TTGTTGCGTAGGCAGGTAGG212Gna14F:GGAAGAGCACCTTTATCAAGCAA R:TCTGCTCACACACGTAAGGGAT165

2 結 果

2.1 差異表達基因

本試驗利用兔的表達譜芯片初步得到不同毛色全同胞獺兔皮膚組織表達譜，以每組的白色獺兔基因表達值為對照，青紫藍色獺兔基因的表達值分別與其對比，按照差異倍數≥2或≤0.5的標準篩選差異基因，3組分別篩選出了545、1 680和2 092個差異表達基因，經韋恩分析后發現3組共有差異表達基因172個(圖1)。在第1組中，111個基因在青紫藍色獺兔皮膚組織中表達上調，61個基因表達下調；在第2組中，107個基因在青紫藍色獺兔皮膚組織中表達上調，65個基因表達下調；在第3組中，92個基因在青紫藍色獺兔皮膚組織中表達上調，80個基因在青紫藍色獺兔皮膚組織中表達下調。172個基因中有89個在3組中表達趨勢一致，其中62個基因在青紫藍色獺兔皮膚組織中表達上調，27個基因在青紫藍色獺兔皮膚組織中表達下調。表2列出了其中的20個差異表達基因。

2.2 GO分類結果

篩選得到的差異基因經過 GO(http://www.geneontology.org/)進行功能分類，結果見表3。這些差異基因參與生物學過程的調控、細胞、代謝等生物學過程(圖2)。其中生物學過程的調控、生物學調節、細胞過程、代謝過程占10%以上，多細胞有機體過程、發育過程、定位、建立定位、一體化過程都占5%～10%，其他的生物學過程都占5%以下。

圖1 3組差異基因的Venn.分析Fig.1 Venn.analysis of the DEGs in 3 groups

2.3 相關差異表達基因信號通路富集

172個共同差異表達基因中，大部分基因處于已研究發現的KEGG、Biocarta信號通路，他們存在于多條KEGG、Biocarta信號通路中，例如Creb1基因處于絲裂素活化蛋白激酶信號通路(MAPKinase Signaling Pathway)等12個Biocarta信號通路，以及黑素生成(Melanogenesis)等5個KEGG信號通路。本試驗找出了一些與色素形成相關的信號通路以及相關的差異基因(表4)。

表2 3組中表達趨勢一致的20個差異基因

Table 2 20 common differentially expressed genes in 3 groups

基因名稱GenesnameGenBank登錄號GenBankaccessionnumber差異倍數Foldchange第1組Group1第2組Group2第3組Group3Creb1NC_013675.13.382.352.68GnaqNC_013669.13.752.723.73THAF493546.13.072.812.66Gna14NC_013669.12.122.252.01Camk2aNC_013671.12.272.453.36Mapk12NM_013871.35.392.562.85Actn2NC_013684.12.052.032.02Dvl1NM_010091.32.362.122.56ST1A8NC_013674.13.163.273.18TtnNC_013675.15.405.493.34Reg4NC_013681.12.064.062.85Htr5bNC_013675.14.162.052.65Zfp11NM_172462.42.072.160.28Igsf1NC_013690.12.063.353.95Adrbk2NM_177078.32.073.802.23SctrNC_013675.10.320.290.12CgaNC_013680.10.310.460.08Wnt2NM_001171042.10.310.410.38Dnahc6NM_001370.10.110.460.42EgfrNC_013678.10.470.460.36

表3 分子生物學過程相關基因GO分類

Table 3 GO term to gene in biological process

基因功能分類Thefunctionalclassificationofgenes基因數NumberofgenesGO分類號GONo.生物學過程的調節Regulationofbiologicalprocess1320050789生物學過程的負調控Negativeregulationofbiologicalprocess350048519生物學過程的正調控Positiveregulationofbiologicalprocess380048518生物學調節Biologicalregulation1350065007一體化過程Multi-organismprocess700051704建立定位Establishmentoflocalization850051234定位Localization900051179刺激應答Responsetostimulus420050896運動Locomotion320040011生長Growth40040007發育過程Developmentalprocess900032502繁殖Reproduction30000003免疫系統過程Immunesystemprocess480002376代謝過程Metabolicprocess1330008152細胞生理過程Cellularprocess1380009987解剖結構形成Anatomicalstructureformation200010926凋亡Death190016265生殖過程Reproductiveprocess80022414生物黏附Biologicaladhesion120022610多細胞有機體過程Multicellularorganismalprocess1120032501

圖2 分子生物學過程相關基因GO分類Fig.2 GO term to gene in biological process

表4 色素形成相關的信號通路

Table 4 Signal pathway related to pigment formation

通路名稱Nameofpathway差異表達基因Differentiallyexpressedgenes黑素生成MelanogenesisWnt2、Gnaq、Dvl1、Creb1黑素細胞發展和色素通路MelanocytedevelopmentandpigmentationpathwayCreb1酪氨酸代謝TyrosinemetabolismTH絲裂素活化蛋白激酶信號通路MAPkinasesignalingpathwayMapk12、Creb1

2.4 熒光定量PCR驗證差異基因

為驗證芯片結果的可靠性，本研究從芯片雜交結果中選取4 個基因進行熒光定量 PCR驗證。芯片和實時定量 PCR 的結果比較見表5。結果顯示，Creb1、Wnt2、Gnaq和Gna14 各基因的表達譜芯片和熒光定量兩個試驗所得的表達倍數雖然不同，但二者的表達趨勢基本相同(圖3)，因此認為芯片的篩查結果可靠。

3 討 論

表達譜芯片是基因芯片的一個重要分支，其方法已經相對成熟，并研制出許多物種的商品化表達譜芯片產品[17]。楊靜等[18]利用表達譜芯片技術篩選子宮頸上皮內瘤變發展成子宮頸癌危險性相關的差異表達基因發掘了ANKRD20A1、OLFM4、SNORD等13個在子宮頸癌發生的早期階段發揮重要作用的基因。李挺[19]通過表達譜芯片技術找到了新西蘭白兔與福建黃兔背肌和腿肌中共有的Tnnc1、Myo5b、Tpm3等7個影響兔肌肉生長發育的基因。本研究利用Agilent兔全基因組表達譜芯片篩選出了青紫藍色獺兔相對于白色獺兔的差異表達基因，并且選取部分基因進行熒光定量PCR驗證，結果顯示，芯片結果與熒光定量結果中基因表達量基本一致，說明利用表達譜芯片技術篩選毛色性狀相關候選基因是可靠的途徑。

本試驗利用GO功能分類對篩選的差異表達基因進行生物學過程分析，結果顯示，差異表達基因主要參與細胞黏附、增殖、分化及凋亡等細胞過程，以及發育、離子轉運等生物學過程。本研究通過表達譜芯片結果結合生物信息學分析和文獻報道，篩選出TH、Creb1、Wnt2、Dvl1、Gnaq、Mapk12等與獺兔毛色形成過程相關性較大的候選基因，與前人的研究結果一致。本研究中酪氨酸羥化酶基因(Tyrosine hydroxylase，TH)在3組不同毛色獺兔表達譜芯片中的差異表達倍數均大于2，提示該基因可能與獺兔毛色形成相關，其編碼的酪氨酸羥化酶是一種以酪氨酸為底物，并催化酪氨酸形成多巴的酶，是多巴和兒茶酚胺生物合成過程中的關鍵步驟和第一個限速酶[20]。 韓宇等[21]認為，TH基因控制家蠶體內黑色素的形成。本研究中cAMP反應元件結合蛋白基因(cAMP response element binding protein，Creb1)在3組不同毛色獺兔表達譜芯片中也具有差異表達。cAMP反應元件結合蛋白是G蛋白耦合受體信號(GPCR)中最重要的一個核轉錄因子。卜今[22]的研究表明，丹皮酚能通過活化JNK/SAPK途徑，激活下游的酶性蛋白，抑制磷酸化Creb，進而下調Mitf基因，減少Tyr基因的表達，抑制黑素合成。Creb1基因是該Creb家族基因中非常重要的一員，E.R.Price等[23]研究發現，在正常的黑色素細胞中，色素沉著信號從Mc1r基因傳遞到Mitf基因需要Creb1基因的參與。在篩選得到的差異基因中，Wnt2是Wnt家族的成員之一，Wnt/β-catenin通路是一條保守的信號通路，廣泛存在各種動物細胞內。Wnt家族是一個非常龐大的多基因家族，主要參與細胞的增殖與分化過程。Wnt可以與細胞表面的Frizzled受體結合，通過GPCR激活dishevelled(DVL)蛋白從而調節β-catenin[24]。Dvl在Wnt信號通路激活過程中，介導Wnt信號傳遞到不同的途徑，起著信號分流作用。G.M.Boland等[25]研究發現，過量表達Dvl1基因能夠使β-catenin在胞質中穩定積累。于秋菊等[26]研究表明，β-catenin在棕色羊駝皮膚組織中的基因表達量高于白色羊駝，可能與羊駝毛色形成具有相關性。K.Pham等[27]研究發現，Wnt2在惡性黑色素瘤中過表達。Gnaq基因編碼的Gnaq蛋白是異源三聚體G蛋白中a亞基下游中的亞基基因，其功能是將信息從細胞表面受體傳遞到細胞內，在黑素細胞內皮素B受體中發揮重要作用，存在于包括皮膚在內的各種組織中。M.A.Davies等[28]研究指出，黑色素細胞中Gnaq蛋白的突變體和其他一些基因協作誘導小鼠黑色素瘤的形成。C.D.Van Raamsdonk等[29]研究表明，Gnaq超效等位基因的突變會引起真皮內黑色素細胞增加從而導致皮膚色素擴散。Mapk12基因編碼的絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)參與生物體內的多種受體信號傳遞途徑，C.D.Van Raamsdonk等[30]研究表明，MAPK信號通路作用于黑色素小體的轉運，可能在眼色素瘤和色素痣中發揮作用。

表5 熒光定量PCR與表達譜芯片的基因表達比較

Table 5 The comparison of gene expression level between quantification RT-PCR and chip

基因Genes組別Groups表達譜芯片差異倍數Foldchangechip實時熒光定量PCR差異倍數qRT-PCRfoldchangeCreb113.384.3522.352.2832.683.23Wnt210.310.8320.410.3330.380.42Gnaq13.752.0522.723.8533.732.44Gna1412.121.8822.252.5632.011.92

圖3 芯片與熒光定量PCR結果比對Fig.3 The comparisons on analysis result of microarray and qRT-PCR

4 結 論

本研究利用基因芯片技術篩選出同一窩出生的青紫藍色獺兔和白色獺兔中差異表達基因，共篩選出172個基因，參與了細胞的增殖、分化、凋亡，信號傳遞、離子轉運、催化酶的活性、蛋白結合等多種細胞生物學過程。其中Creb1、Gnaq、Mapk12、TH、Wnt2、Dvl1基因的差異表達，表明這些基因可能是對獺兔毛色形成具有重要影響的候選基因。

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(編輯 程金華)

Screening Candidate Differentially Expressed Genes of Rex Rabbits’ Fur Color with Gene Chips

SHI Li-juan1，2，QIN Li-zhi1，2，WANG Wen-zhou1，2，YAN Xiao-rong1，2，WENG Qiao-qing3，WU Xin-sheng1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuKeyLaboratoryofAnimalGenetics&BreedingandMolecularDesign，Yangzhou225009，China；3.ZhejiangYuyaoXinnongRabbitIndustryCo.，Ltd.，Yuyao315400，China)

In order to explore the molecular genetic mechanism of fur color formation between chinchilla rex rabbits and white rex rabbits.The experiments were divided into 3 groups，every group contained one chinchilla rex rabbit and one white rex rabbit，which came from full-sib family.The Agilent’s rabbit gene expression microarray was used to determine the differentially expression genes between different fur color groups of rex rabbits，and the expression patterns of selected differentially expressed genes were further identified by quantitative real-time PCR.The results showed that 545，1 680 and 2 092 differentially expressed genes associated with fur color of rex rabbits were screened out from 3 groups of chinchilla rex rabbits and white rex rabbits，respectively.A total of 172 mutual genes were found among these 3 rex rabbits groups.GO (Gene Ontology) analysis results revealed that the differentially expressed genes were related to cell differentiation，proliferation，apoptosis，growth，ionic transport altered and immune response，etc.The quantitative real-time PCR showed gene expression trend ofCreb1，Wnt2，GnaqandGna14 genes was consistent with that of gene expression microarray data，indicating that the result of gene chip was reliable.Combined with bioinformatic analysis and related literatures，some genes were potentially related to fur color formation，such asCreb1，TH，Wnt2，Gnaq，Dvl1，Mapk12，and so on.

rex rabbit；fur color；DEGs；gene chip

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.009

2014-09-05

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-44-1)；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD-2014-134)

施麗娟(1990-)，女，江蘇南通人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:msbdmy@126.com

*通信作者：吳信生，教授，博士，E-mail:xswu@yzu.edu.cn

Q81；S829.1

A

0366-6964(2015)04-0568-08