黃芪多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的保護作用

張 晨 黃 進 詹 菲 張 進

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州，510006； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣州，510405)

黃芪多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的保護作用

張 晨1黃 進2詹 菲1張 進1

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州，510006； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣州，510405)

目的：觀察黃芪多糖(APS)對四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纖維化的治療作用。方法：采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，造模成功后，取大鼠血清和肝組織進行檢測。測定血清肝纖維化四項、肝臟組織中羥脯氨酸(HYP)含量；HE染色比較炎癥及肝纖維化程度；免疫組織化學(xué)法分析肝組織中I型膠原(Col-I)、平滑肌肌動蛋白α(α-SMA)表達量。結(jié)果：與模型組相比，APS中、高劑量組的肝纖四項水平、炎癥及肝纖維化程度明顯降低(P<0.05)；APS中、高劑量組肝臟組織中HYP含量顯著降低(P<0.01)；APS中劑量組Col-I、α-SMA表達顯著減少(P<0.01)；APS高劑量組Col-I、α-SMA表達明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：APS對大鼠肝纖維化具有一定的防治作用，作用機制可能與其抑制Col-I、α-SMA表達有關(guān)。

肝纖維化；黃芪多糖；四氯化碳

近年來，中醫(yī)藥抗肝纖維化基礎(chǔ)與臨床研究成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點之一，其中作用機制的研究更是備受關(guān)注[1-3]。在抗肝纖維化的眾多藥物中，中藥黃芪及其復(fù)方制劑是一類有很大發(fā)展?jié)摿Φ乃幬铩｜S芪能夠減少免疫損傷所致肝內(nèi)膠原成分的異常沉積和調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[4-6]，對實驗性肝纖維化有明顯的治療作用。黃芪多糖(APS)是黃芪主要生物活性成分。大量體內(nèi)外實驗及臨床研究表明，APS具有增強機體免疫力、降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和抗氧化等多種藥理功效[7]。本實驗基于CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，使用APS進行干預(yù)，以探究該藥物對大鼠肝纖維化的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雄性，體重180～220 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(粵)2013-0020。

1.2 主要試劑和儀器 黃芪多糖(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；四氯化碳(天津富宇精細化工有限公司)；羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140605)；山羊血清封閉液(武漢博士德，批號：AR0009)；Col-I、α-SMA一抗(Abcam公司，批號：ab34710、ab5694)；二抗(基因科技公司，批號：GK600505)；智能生物組織脫水機(益迪YD-129)；石蠟包埋冷凍機(益迪YD-6L)；石蠟切片機(益迪YD-AB)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CX31)。

2 方法

2.1 模型制備和給藥 SD大鼠50只按體重隨機分成正常組、模型組、APS組(低、中、高)5組，每組10只。參照文獻[8]，除正常組皮下注射花生油溶液外，其他各組大鼠由皮下注射60% CC14花生油溶液，首次注射5 mL/kg，以后以3 mL/kg每隔3 d注射1次，連續(xù)注射8周建立大鼠肝纖維化模型。APS組每天給予APS灌胃1次，低、中、高組劑量分別為0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水。末次給藥1 h后，水合氯醛麻醉大鼠，收集腹主動脈血和肝臟組織。

2.2 觀察指標(biāo)和檢測

2.2.1 血清學(xué)指標(biāo)分析 大鼠麻醉后腹主動脈取血約5 mL，3000 r/min離心15 min取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ詣由治鰞x常規(guī)檢測各組血清樣本的肝纖維化指標(biāo)：血清透明質(zhì)酸(HA)，層黏蛋白(LN)，Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，Ⅳ型膠原(CIA)。

2.2.2 肝組織中HYP含量測定 稱取肝臟濕重約50 mg，準(zhǔn)確加水解液1 mL，混勻。嚴格按照羥脯氨酸檢測試劑盒說明測定各管的OD值，根據(jù)計算公式：HYP含量(μg/mg)=(測定OD值-空白OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品含量(5 μg/mL)×水解液總體(10 mL)÷組織濕重(mg)，計算肝組織中的HYP含量。

2.2.3 HE染色 取大小約為1 cm×1 cm×1 cm肝組織，保存于10%甲醛溶液中。24 h后，開始脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，行常規(guī)HE染色。光鏡下觀察肝組織病理改變，隨機選取10個100倍視野，觀察并比較炎癥及肝纖維化程度。

2.2.4 免疫組織化學(xué)染色分析肝組織中Col-I、α-SMA表達量 大鼠處死之后，取同一部位肝組織，大小為1 cm×1 cm×1 cm。組織樣本處理：1)依次進行甲醛固定、不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟封片、切片、烤片；2)染色：二甲苯脫蠟15 min，重復(fù)3次，依次經(jīng)乙醇(100%、95%、85%、70%、50%)脫水各5 min。3% H2O2、純水漂洗各3 min。檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，正常山羊血清封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，正常對照組以PBS代替一抗，平衡鹽漂洗。二抗37 ℃孵育30 min，平衡鹽漂洗。DAB染色，蘇木精復(fù)染，去離子水迅速沖洗，0.1%鹽酸酒精分化20 s。最后依次沖洗、脫色、透明、封片、干燥。染色結(jié)果以組織出現(xiàn)黃色或黃褐色為陽性。用已知陽性片作陽性對照，普通光學(xué)顯微鏡低倍鏡確定陽性表達位置，移至高倍鏡(×200)下拍攝病變組織5個視野照片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計算平均灰度值。

3 結(jié)果

3.1 模型制備及大鼠死亡情況 本次實驗在第12、15周每組各處死1只大鼠用于HE染色，用于判定模型建立是否成功。實驗期間大鼠共死亡5只，其中模型組2只，APS(低、中、高)組各死1只。大鼠死亡前活動度明顯降低，進食減少，體重減輕，消瘦，考慮為CC14慢性中毒而死。

3.2 各組大鼠血清中肝纖維化四項含量變化 與正常組比較，模型組大鼠血清肝纖維化四項水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，APS中、高劑量明顯降低大鼠血清中肝纖維化四項水平(P<0.05)。見表1。

3.3 肝組織中HYP含量變化 與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織HYP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，APS中、高劑量顯著降低大鼠肝組織中HYP水平(P<0.01)。見表1。

3.4 各組大鼠肝臟組織HE染色 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，中央靜脈匯管區(qū)動靜脈和膽管結(jié)構(gòu)正常，未見肝竇擴張，無膠原纖維，未見炎細胞浸潤與膠原纖維增生；模型組大鼠肝組織正常肝小葉紊亂無序，肝細胞結(jié)構(gòu)完全被破壞，可見纖維結(jié)締組織明顯增生，大部分肝細胞表現(xiàn)為片狀壞死，形成大小不一的典型的假小葉結(jié)構(gòu)，假小葉內(nèi)以充斥著脂肪變的肝細胞為主，匯管區(qū)明顯擴大，壞死細胞增多；APS組大鼠表現(xiàn)均輕于模型組，肝小葉樣結(jié)構(gòu)較模型組正常，未見假小葉形成，膠原纖維增生不典型。見圖1。

3.5 各組大鼠肝臟組織中Col-I、α-SMA表達量的差別 正常組多呈低水平表達，染色淡，局部表達不明顯；模型組多呈高水平表達，染色呈強陽性，染色多為棕黃色，廣泛分布；APS中、高劑量組表達介于正常組與模型組之間，表達面積和強度較模型組顯著為弱，纖維間隔染色淡。APS低劑量組陽性表達面積高于中、高劑量組，染色較深且廣泛。將染色結(jié)果按照換算為顯色指數(shù)，比較各組對肝組織Col-I、α-SMA表達的影響。與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中Col-I、α-SMA表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，APS中、高劑量組大鼠肝臟組織中Col-I、α-SMA表達量顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見表2，圖2、3。

表1 血清HA、LN、PCⅢ、CIA含量(ng/mL)和肝組織中HYP(μg/mg濕重)比較

注:與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表2 肝臟組織中Col-I、α-SMA表達量比較

注:與正常組比較,*P<0.01，與模型組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01。

圖1 大鼠肝組織HE染色(×100)

注:A：正常組；B：模型組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組。

圖2 大鼠肝組織Col-Ⅰ表達(×200)

注:A：正常組；B：模型組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組。

圖3 大鼠肝組織α-SMA表達(×200)

注:A：正常組；B：模型組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組。

4 討論

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積，是機體對慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，也是各種急慢性肝病共同的病理過程。CCl4皮下注射是建立肝纖維化模型的基本方法。本次實驗大鼠皮下注射60%CCl4，8周后，造模大鼠逐漸表現(xiàn)為精神萎靡，行動遲緩，毛色干枯蓬亂發(fā)黃，體重明顯下降，通過血清肝纖四項及肝組織HE染色分析，提示肝纖維化大鼠模型造模成功。本結(jié)果顯示，APS各劑量組大鼠的肝纖四項、血清和肝組織中HYP含量以及病理纖維化程度均明顯低于模型組，提示APS在一定程度上可抑制肝纖維化的進程。

肝臟中有多種蛋白，其中以Col-I為主。在正常肝臟中，膠原蛋白約占5%～10%，肝纖維化時膠原蛋白可占肝臟總蛋白的50%[9]。因此，Col-I是肝纖維化過程中ECM的主要成分。膠原主要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾，去除端肽及交聯(lián)等合成。則作用于膠原合成的任何一個環(huán)節(jié)均有可能減少膠原在肝臟細胞外間質(zhì)的沉積[10]，提示Col-I在肝纖維化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。HYP是一種非必需氨基酸，也是膠原代謝的重要產(chǎn)物。人體HYP占膠原蛋白比例最大，膠原蛋白是組織中膠原纖維的主要成分，膠原纖維廣泛分布于人體各個組織。因此，膠原蛋白占人體蛋白質(zhì)很大比例。我們根據(jù)HYP在膠原蛋白中含量最高這一屬性，通過對肝組織中HYP的測定，可以了解肝臟中膠原蛋白的代謝情況，也可間接反映肝纖維化的程度和發(fā)展過程[11-12]。當(dāng)肝臟受到損傷因素的不斷刺激時，多途徑共同激活肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞，并促使表達大量的α-SMA蛋白，導(dǎo)致肝臟內(nèi)的ECM合成增多，而降解減少，造成膠原大量沉積，于是肝纖維化逐漸形成。所以，大量的α-SMA蛋白表達，在肝纖維化的形成中起關(guān)鍵性作用[13-14]。有報道顯示[15]，α-SMA陽性細胞主要集中在匯管區(qū)、纖維間隔內(nèi)以及竇周間隙的間質(zhì)細胞，隨著肝纖維化的發(fā)展，α-SMA陽性細胞數(shù)明顯增多。因此，抑制α-SMA表達[16]、促進ECM的降解[17]與否是促進肝纖維化逆轉(zhuǎn)非常重要的靶點。

本實驗結(jié)果顯示，APS中、高劑量明顯抑制肝纖維化大鼠Col-I表達，且APS中、高劑量組大鼠肝臟組織中α-SMA表達量明顯降低，表明APS抗肝纖維化的作用與其降低Col-I、α-SMA表達有關(guān)。APS可能是通過抑制Col-I、α-SMA表達，來抑制ECM的生成并促進ECM的降解，從而發(fā)揮保護肝臟和抗肝纖維化的作用。

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(2014-08-01收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Protective Effect of Astragalus Polysaccharide on Liver Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride in Rats

Zhang Chen1，Huang Jin2，Zhan Fei1，Zhang Jin1

(1BasicMedicalCollegeofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2GuangzhouUniversityofChineseMedicineclinics,Guangzhou510405,China)

Objective:To study the protective effect of the Astragalus polysaccharides (APS) on liver fibrosis in rats caused by carbon tetrachloride (CCl4).Methods:CCl4was used to induce rat liver fibrosis model. After making the model successfully, rat serum and liver tissue were collected to test. The serum liver fiber four and hydroxyproline (HYP) content in the liver tissue was tested; HE staining of liver tissue was used to compare inflammation and degree of liver fibrosis; expression of Col-I and α-SMA with immunohistochemical method was analyzed.Results:Compared with the model group, four levels of liver fibrosis, inflammation and liver fibrosis of APS high and medium groups were obviously lower(P<0.05); HYP content of APS high and medium groups were significantly lower (P<0.01); Col-I and α-SMA expression of APS medium group was significantly lower (P<0.01); Col-I and α-SMA expression of APS high group was obviously lower (P<0.05).Conclusion:The APS is effective to some extent in preventing liver fibrosis of rat, the functional mechanism may be related to limiting the expression of Col-I and α-SMA.

Liver fibrosis; Astragalus polysaccharides; Carbon tetrachloride

廣州中醫(yī)藥大學(xué)高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(編號：20114425120015)

張晨，男，陜西安康人，碩士研究生，研究方向：主要從事藥效研究工作，E-mail：zhangchenak1990@126.com

黃進(1981—)，女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，研究方向：主要從事藥效研究工作，E-mail：huangin2010@gzucm.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.022