銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥的耐藥機制研究進展

張 妍 綜述，張 立 審校

（海河醫院檢驗科，天津300350）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）屬假單胞菌屬，革蘭陰性桿菌，是醫院感染的重要條件致病菌，能引起人和動物的感染，也是慢性感染的常見致病菌，治療非常困難。美國國家醫院感染監測系統（NNIS）報告指出PA 在所有院內感染致病菌中檢出率居第5 位，在革蘭陰性菌中檢出率居第2位［1］。近年來由于大量抗菌藥物的廣泛使用，PA 耐藥率在逐年遞增，多藥耐藥PA 的數量和耐藥率不斷上升［2］，為臨床帶來很大困難。PA 具有目前已知的細菌耐藥的主要機制，已經成為引起院內獲得性肺炎多重耐藥的代表性革蘭陰性菌［3－4］。

碳青霉烯類抗菌藥物是新型的β－內酰胺類抗菌藥物，具有高效廣譜的特點，是治療PA 感染的關鍵藥物之一，對大多數β－內酰胺酶穩定，通過滲透細菌外膜作用進入細菌內，殺菌活性強大［5］。近年來，隨著大量抗菌藥物的使用，特別是碳青霉烯類藥物的使用，PA 耐藥率不斷上升，而各種β－內酰胺酶的產生是PA 對抗菌藥物的各種耐藥機制中最主要的機制［6］。本文就PA 的這一耐藥機制作一綜述。

1 PA 的生物學特性

PA 又名綠膿桿菌，為人體正常菌群，是臨床常見的條件致病菌，專性需氧菌，廣泛存在于醫院環境，引起院內免疫力低下患者感染。其主要引發的感染有肺部感染、心內膜炎以及敗血癥等，由于菌體很難清除，常引起感染的反復發作［7－8］。國內有文獻報道，老年患者由于多器官功能衰退，PA 也已成為了老年患者感染的主要致病菌，檢出率28.2%，占致病菌的首位［9］。此外，侵入性操作，如氣管插管、留置導尿管、纖維支氣管鏡等會引起機械性損傷減低防御功能，從而導致PA 傳播及細菌耐藥性的發展［10－11］。燒傷、創傷患者創面為PA 的定植感染創造條件。劉樹華等［12］的研究顯示迄今為止，引起燒傷患者醫院感染的細菌仍以革蘭陰性桿菌為主，其中PA 最常見，當患者出現皮膚黏膜損壞及免疫功能下降時，容易導致創面PA 感染。

2 碇青霉烯類抗菌藥物的抑菌機制

碳青霉烯類抗菌藥物是新型β－內酰胺類藥物，其中亞胺培南為世界上第一個碳青霉烯類抗菌藥物［13］，該藥物抗菌譜廣、活性強，對β－內酰胺酶穩定。亞胺培南對β－內酰胺酶有耐受作用，對細菌細胞壁外膜有較好的穿透性，抑制細胞壁黏肽的合成，通過阻礙細胞壁合成而起殺菌作用，它對大腸埃希菌等細菌的殺菌作用與第三代頭孢菌素類相似，而它對PA 和厭氧菌有較強大的作用。

3 PA 的耐藥現狀

PA 對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在整個世界范圍內為逐年上升的趨勢。亞太地區耐藥監測在2010 年有報道顯示，PA 對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為27.7%和21.6%［14］。在我國，各地區的PA 對兩種藥物的耐藥性也越來越高，其中華東地區高達25.7%和22.5%［15］。武曉敏等［16］研究報道稱，PA 對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達30%以上。彭超等［17］研究報道稱，在神經內科檢測出的PA 菌200例與19中抗菌藥物耐藥性檢測中，美羅培南的耐藥性為25%，而耐藥率最低的為多黏菌素E，為8%。PA 對抗菌藥物耐藥率不斷的升高正是由于近年來碳青霉烯類抗菌藥物的大量廣泛使用。

4 PA 的耐藥機制

PA 的耐藥機制復雜多樣，外膜蛋白是許多抗菌藥物進入細菌體內的通道，由于PA 的外膜上有許多微孔通道蛋白，使多種革蘭陰性菌的抗菌藥物難以通過，從而具有很多種抗菌藥物的天然耐藥性，同時也會因為基因的突變而獲得耐藥性，所以產生β－內酰胺酶，外膜的通透性障礙，形成生物膜，主動外排系統的表達等均是其主要的耐藥機制［18］。

4.1 β－內酰胺酶的產生 PA 對β－內酰胺類抗菌藥物耐藥主要是它可以產生多種β－內酰胺酶［19］，此酶可以通過水解或非水解方式破壞β－內酰胺環，使抗菌藥物相應失活。PA 產生的β－內酰胺酶主要包括金屬β－內酰胺酶（MBLs）、超廣譜β－內酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）。

4.1.1 MBLs MBLs又稱碳青霉烯酶或金屬酶，主要存在于鮑曼不動桿菌和PA 中，能水解碳青霉烯類抗菌藥物在內大多數β－內酰胺抗菌藥物使其失活，此酶有多種，國內外研究發現幾種類型：IMP、VIM、SPM、GIM、AIM，其中主要基因型為IMP和VIM［20］。這兩型均有20余種亞型分別由相應編碼基因的不同位點發生突變產生［21］。編碼金屬酶基因位點存在于PA 的質粒或染色體上。以基因盒存在于整合子之中，大部分的基因位Ⅰ型整合子少數位于Ⅲ型整合子中，通過質粒和整合子的作用，使耐藥性在細菌間水平傳播。在國外報道中，發現產MBLs的PA 產生與遺傳因素相關，說明MBLs的基因擴散是由耐藥基因在不同菌種之間的傳遞和克隆引起的［22］。

4.1.2 ESBLs ESBLs編碼基因有多種，包括：TEM 型、SHV型、OXA 型、VEB 型、GES 型、CARB 型、PER 型、CTX 型、LCR 型、BEL型等。其中以TEM 型、OXA 型研究最多。這些主要是由基因位點衍生突變而來，ESBLs的基因大多位于質粒和染色體DNA 上，PA 能夠通過轉化、傳導、結合的方式使ESBLs基因在質粒和染色體中轉移、傳播，并進行特異性整合和重組從而引起耐藥產生。ESBLs降低與碳青霉烯類抗菌藥物的親和力，引起青霉素類、氨曲南和碳青霉烯類耐藥。

4.1.3 AmpC酶 AmpC酶屬Bush1群，按Ambler分子結構分類為C類，其優先選擇的底物為頭孢菌素類。其表現為對頭霉素抗菌藥物高度耐藥且不被克拉維酸抑制，但可被氯唑西林抑制。PA 中的AmpC酶分誘導性和非誘導型兩種，正常情況下PA 在沒有誘導劑作用，只有少量AmpC 的產生，但當有誘導作用時，如使用大量三代頭孢菌素后可使其表達水平大大增加［23］。有研究報道，在抗菌藥物的誘導和選擇性壓力下，AmpC酶菌株陽性率由實驗開始的20%增長到90%。從而進一步說明了臨床的不合理使用抗菌藥物會使AmpC 酶菌株廣泛傳播。而產AmpC酶的PA 能水解一至三代頭孢菌素類藥物和頭霉素類藥物，對大多數β－內酰胺類抗菌藥物耐藥從而使耐藥性更加的突出和嚴重。在研究PA 對碳青霉烯類耐藥機制中發現，產AmpC酶菌的13株PA 菌都對厄他培南耐藥，這表明AmpC的產生也是PA 對碳青霉烯耐藥的重要機制［24］。PA 的一些DNA 結合蛋白如ampR、ampD 及其同源基因，通過與AmpC 誘導的輔因子結合轉化為AmpC 活化因子，從而調節AmpC的表達。但并不是PA 的AmpC 酶的表達都完全依賴于ampR、ampD 等的染色體突變［25］。

4.2 外膜的通透性障礙 外膜蛋白是許多抗菌藥物進入細菌體內的通道。PA 外膜上有許多微孔通道蛋白，如OprC、OprD、OprE，均屬小孔道蛋白。只有部分抗菌藥物能通過。其中外膜孔通道OprD 是一種狹窄的孔道蛋白，是以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗菌藥物進入PA 唯一通道［26］。其OprD的基因突變或者缺失造成細胞外膜對抗菌藥物通透性下降，抗菌藥物不能通過，是PA 對亞胺培南等耐藥的重要機制。如OprD 基因突變，表達減少或缺失均導致OprD 蛋白減少或缺失，從而阻礙亞胺培南進入菌體，是造成PA 對碳青霉烯類藥物亞胺培南耐藥的主要機制。OprD2作為亞胺培南特異性通道，OprD2基因缺失也存在缺失突變，編碼區的一段片段缺失導致移碼的突變，形成新的密碼子從而引起肽鏈異常，導致PA 對亞胺培南耐藥。PA 的OprD 基因插入IS失活后，基因編碼將會提前終止，OprD 表達缺失導致PA 耐藥，同時OprD同樣也是一些氨基酸及多肽進入PA 的通道，與碳青霉烯類競爭也會產生 耐藥［27－28］。

4.3 生物膜的形成 生物膜是細菌自身分泌的多糖蛋白混合物，具有一定韌性和厚度，具有極強的耐藥性和抵抗免疫系統的作用，對細菌發揮保護作用。隨著醫學材料廣泛應用和病房各種置管操作的增多，從而使PA 很容易形成生物膜，導致感染。因為PA 的生物膜可分泌胞外多糖，阻礙了抗菌藥物作用于菌體，生物膜具有很強的耐藥性和抗擊機體免疫系統的作用，不僅使細菌生命力更持久，而且毒力基因和耐藥基因能力也大大的增加。Hall－Stoodley等［29］的研究表明，生物膜內細菌可分泌β－內酰胺酶能水解氨基糖苷類，頭孢類抗菌藥物等抗菌藥物可與膜內細菌的外周多糖相互作用。

4.4 主動外排系統的表達 PA 的細胞膜上具有可以將抗菌藥物排出體外，并與外膜蛋白的缺失突變起協同作用，從而導致PA 對多種抗菌藥物耐藥的作用系統，被稱之為細菌的外排系統。根據染色體的不同同源性，可將外排系統分為MFS、RNA、ABC、MATE 和SMR，與碳青霉烯抗菌藥物的耐藥有關，也是最早發現的RNA 外排家族，而PA 中與細菌耐藥有關的是RNA 外排家族［30］。目前在PA 中已有報道有7種外排泵，包 括MexAB－OprM、MexEF－OprN、MexXY－OprM、Mex－CD－OprJ等7種，其中最常見的是MexAB－OprM 系統［31］。各種外排系統的轉運底物不完全相同，其中當碳青霉烯類抗菌藥物經外膜孔蛋白進入膜間隙，在內膜外側中會被MexB 捕獲，借膜融合蛋白MxeA 的橋聯作用經外膜蛋白OprM 排出菌體外。有研究發現MexEF－OprN 外排系統表達上升時可引起亞胺培南和美羅培南兩者的MIC值都升高，也有研究認為Mex－EF－OprN、MexAB－OprM 和MexXY－OprM 外排系統的過度表達均可引起PA 對美羅培南的耐藥，而對亞胺培南的影響不大。因為MexAB－OprM 和MexXY－OprM 在菌株中的低水平表達導致了對大量抗菌藥物的獲得性耐藥及固有耐藥，其中MexAB－OprM 的過度表達最為重要，它將進入菌體的美羅培南轉運出胞質引起耐藥，是PA 對美羅培南耐藥的主要機制而對IMP影響不明顯［32］。隨著廣譜抗菌藥物的大量使用，能夠通過細菌的外排泵的底物會不斷增加，PA 外排系統也會增加，從而造成它的更嚴重的耐藥問題。

5 小 結

PA 感染是目前各級醫院中最廣泛、最嚴重的問題之一，其本身具有對多種抗菌藥物固有的天然耐藥，又極易產生獲得性耐藥，從而為臨床的治療帶來很大的困難和挑戰。而PA 的耐藥機制又尤為復雜，天然耐藥、獲得性耐藥、選擇性耐藥并存。綜上所述，PA 作為臨床常見的分離菌，其耐藥機制需要更深入的研究，以獲得更有效的手段減少耐藥發生。合理的使用抗感染藥物，加強對PA 的監測，采取有效措施控制耐藥菌株出現，及時切斷多重耐藥菌株的水平傳播，依據藥敏試驗結果，合理選用抗菌藥物，對提高抗菌藥物的治療效果尤為重要。

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