大腸埃希菌sdi A基因缺失株的建立*

伍彬寧，蔡壬辛，曾建明，鄂順梅，李有強，葉大檸，魯 洋，陳 茶

（廣州中醫藥大學第二臨床醫學院檢驗醫學部，廣東廣州 510006）

大腸埃希菌sdi A基因缺失株的建立*

伍彬寧，蔡壬辛#，曾建明，鄂順梅，李有強，葉大檸，魯 洋，陳 茶△

（廣州中醫藥大學第二臨床醫學院檢驗醫學部，廣東廣州 510006）

目的為研究HSL信號分子對大腸埃希氏菌的影響而建立大腸埃希菌sdi A基因缺失株。方法通過Red重組系統敲除大腸桿菌BW25113和SM10λpir的sdiA基因，PCR測序鑒定；不同時間點檢測A600值，繪制細菌生長曲線；熒光定量PCR檢測csg D、csg B基因水平。結果PCR測序結果經DNAman軟件比對分析，與預想結果一致；與野生株相比，sdiA基因突變對細菌生長曲線無明顯影響。結論成功建立BW25113、SM10λpir的sdi A基因缺失株，為后續研究銅綠假單胞菌信號分子HSL對大腸埃希菌的影響奠定了基礎。

大腸埃希菌； 基因敲除； Red重組系統； sdi A基因； HSL信號分子； 接合反應

銅綠假單胞菌（PA）是臨床常見的條件致病菌，近年來，PA耐藥問題日益嚴重。目前認為基因水平轉移是介導細菌耐藥的重要途徑，其方式有：轉化、轉導和接合。接合介導的耐藥基因水平轉移是PA多重耐藥的重要原因，但PA接合的調控機制尚不清楚。有研究證明Ti質粒在根癌土壤桿菌結合轉移過程中受到一種由細菌釋放，稱為接合因子的信號分子的調控。接合因子實質上是一種酰基高絲氨酸內酯（HSL）分子，能提高Ti質粒轉移的頻率［1-2］。目前，有研究證實PA等革蘭陰性菌廣泛存在“群體感應”系統。在“群體感應”系統中，HSL分子作為自誘導劑來監測群體密度［3］。當細菌達到一定數量后，HSL濃度升高到一定閥值，啟動一系列基因的表達，調節細菌的群體行為，如：PA胞外酶的產生、發光菌的生物發光性、Ti質粒的接合轉移、細菌抗生素的合成、毒性因子的表達、生物膜的形成等。課題組前期在國家自然科學基金資助下研究PA信號分子HSL對大腸埃希菌（E.coli）-PA接合反應的影響，結果發現HSL有促進接合反應，并引起接合相關基因tra I、traG和trbC表達增高的作用。研究發現，轉錄因子sdi A是供體菌E.coli中唯一的HSL受體蛋白，為明確sdi A在接合中的作用，本文通過基因同源重組技術突變供體菌E.coli SM10λpir的sdiA基因，為后續研究HSL信號分子對E.coli-PA接合體系的影響打下基礎。

1 材料方法

1.1 材料 BW25113菌株和基因敲除所用質粒［4］：p KD3、p KD46、pCP20由Barry L.Wanner教授惠贈，見表1。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 sdiA基因突變所用引物D-sdiA_F/R引物序列參考文獻［5］進行設計，另外按NCBI數據庫中E.coli基因組序列（登錄編號：NC_000913.2）設計測序引物C-sdi A_F/ R，見表2。

1.2.2 基因敲除 本試驗通過Red重組技術敲除E.coli SM10λpir的sdiA基因［4］。以p KD3質粒為模板，引物D-sdi A _F/R擴增重組同源DNA，純化后電轉化SM10λpir（p KD46）感受態，篩選氯霉素抗性克隆，42℃培養消除p KD46質粒后轉化pCP20質粒，再次42℃培養消除氯霉素抗性及pCP20質粒，獲得候選菌株用于后續試驗鑒定。

1.2.3 測序鑒定 以引物C-sdiA_F/R擴增候選菌株，PCR產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳成像，同時送測序，測序結果用DNAman軟件比對分析。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 挑取單個SM10λpir野生株及sdiA突變株菌落至3 m L LB培養液中，37℃、200 r/min搖菌過夜，按1∶100比例稀釋到新鮮LB培養基中，30℃、200 r/ min搖菌8 h，離心收集菌液提取RNA后通過SYBR Green染料法定量檢測csg D和csg B基因表達，rpoD為內參基因，引物序列見表2。

1.2.5 生長曲線和細菌染色 從-80℃取E.coli SM10λpir sdi A基因突變株與野生株，接種血平板，挑取單克隆至3 m L LB液體培養基中37℃，200 r/min增菌12 h，取各菌液調0.5 MCF，再各取20μL至3 m L LB液體培養基中，37℃，200 r/ min，于0、2、4、6、8、10、12 h時，在721分光光度計測定菌液A600值，繪制生長曲線。同時進行常規制片，革蘭染色，光學顯微鏡觀察細菌形態并成像。

2 結 果

2.1 sdi A基因敲除的鑒定 因PCR鑒定引物在sdi A基因突變處上下游約200 bp處，突變后染色體上殘留一個FRT序列，所以PCR產物應為622 bp，而野生株則為1 169 bp。PCR產物電泳結果與預期一致，見圖1。測序峰形圖顯示測序質量良好，結果比對正確，見圖2（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

2.2 細菌生長曲線 細菌生長曲線顯示，E.coli SM10λpir sdi A基因突變株與野生株無明顯差異；此外，細菌培養4 h和12 h時的革蘭染色結果顯示SM10λpir sdi A基因突變株與野生株無明顯差異，提示sdiA突變對細菌表型無明顯影響。見圖3、4（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

2.3 qPCR檢測生物膜相關基因的變化［6］qPCR檢測結果發現E.coli SM10λpir sdiA基因突變株csg D和csg B基因表達量明顯高于野生株，提示csg D和csg B合成受sdi A蛋白影響，見圖5。

3 討 論

本課題組前期試驗發現受體菌PAO1的HSL合成基因缺失將降低E.coli-PA接合反應頻率，因轉錄因子sdi A是供體菌E.coli中唯一的HSL受體蛋白，為明確sdi A在接合中的作用，本研究對供體菌E.coli SM10λpir sdi A基因進行了靶向缺失突變。

Red同源重組是一種利用同源重組方法改變生物體某一內源基因的遺傳學技術。它將靶基因突變位點左右各35～50 bp DNA片段連接到耐藥基因（本實驗為氯霉素CmR）兩側，導入細菌后，在p KD46質粒攜帶的λ噬菌體Red重組酶作用下，與染色體上靶基因發生同源重組，從而實現在基因水平上對目的基因的敲除、替換和突變等操作［4］。本研究以Red同源重組技術敲除sdi A基因，證實該技術是一種高效準確的基因突變技術。

首先，本研究通過PCR測序檢測結果證實sdi A基因突變成功。其次，在細菌表型方面，sdi A基因高表達能夠抑制生物膜成分curli形成。因剛果紅能結合curli和纖維素，是檢測curli形成的非特異性試驗［6］；所以課題組嘗試進行剛果紅試驗驗證。然而結果發現SM10λpir和BW25113 sdi A基因突變株的剛果紅試驗結果與野生株間無明顯差別（未在本文結果中描述），不能用于sdiA突變株表型鑒別。因此，本研究在基因水平上檢測了curli形成相關基因csg D和csg B的表達。結果提示csg D、csg B基因在SM10λpir sdiA缺失株高表達，與文獻報道一致，側面說明試驗菌株建立成功。

文獻報道，E.coli細胞分裂需要ftsQ、fts A和ftsZ產物的參與，而轉錄因子sdiA能識別ftsQAZ基因簇啟動子［7］，促進基因轉錄，并導致細菌分裂加速，形態上多為短桿狀［8-9］。本實驗通過細菌生長曲線和對延緩期、對數期（4、12 h）的細菌進行革蘭染色，發現37℃下sdiA基因的缺失對E.coli SM10λpir菌株的生長曲線和形態無明顯影響，與文獻報道的在sdi A基因高表達的條件下，sdi A蛋白促進細菌分裂現象并不矛盾。

綜上所述，本文成功建立E.coli sdi A基因缺失株，為后續研究PA信號分子HSL對大腸埃希菌的影響奠定了基礎。

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Construction of The sdiA Gene Mutant in Escherichia coli Strains*

Wu Binning，Cai Renxin#，Zeng Jianming，E Shunmei，Li Youqiang，Ye Daning，Lu Yang，Chen Cha△

（Department of Laboratory Medicine，the Second Clinical Medical College of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China）

ObjectiveTo build sdiA gene muants of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir strains.MethodsThe sdiA gene of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were knocked out with Red recombination system.The mutants were detected by PCR technique，and the following sequencing results were analyzed through alignment by software DNAman.Growth curve of strains were assayed by detecting the A600 value at different time point.The csg D and csg B genes expression levels were detected by fluorescent quantitative PCR in SM10λpir sdi A mutant thereafter.ResultsPCR products electrophoresis showed a shorten fragment in mutants comparing to their parental strains BW25113 and SM10λpir，and it was confirmed by DNA sequencing.The growth curves and cells morphology in Gram stain were similar in both mutants and wild-type strains.The expression of csg D and csg B genes was higher in SM10λpir sdiA mutants than those in wild-type strain.ConclusionThe mutants of sdiA deletion of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were constructed successfully，and it will be the foundation for further research of the effects of the signal molecular HSL on Escherichia coli.

Escherichia coli； gene knockout； Red recombination system； sdi A gene； HSL signal molecular； conjugation reaction

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.005

A

1673-4130（2015）17-2466-03

2015-04-28）

國家自然科學基金資助項目（81071397、81271909）；廣東省自然科學基金資助項目（S2013010012970）。 作者簡介：伍彬寧，男，碩士研究生在讀，主要從事臨床微生物學與檢驗的研究；蔡王辛，男，檢驗技師，主要從事臨床微生物與檢驗的研究。#共同第一作者。

△通訊作者，Email：chencha906@163.com。