20株奇異變形桿菌耐藥基因和整合子分布及親緣關系分析*

馮福英，楊湘越，洪 宇，鄭宗富，張 薇，蔣際城，曾 琦

（1.中國人民解放軍第四七六醫院檢驗科，福建福州 350002；2.南京軍區福州總醫院醫學檢驗研究所，福建福州 350025）

20株奇異變形桿菌耐藥基因和整合子分布及親緣關系分析*

馮福英1，楊湘越2，洪 宇1，鄭宗富1，張 薇1，蔣際城1，曾 琦1

（1.中國人民解放軍第四七六醫院檢驗科，福建福州 350002；2.南京軍區福州總醫院醫學檢驗研究所，福建福州 350025）

目的了解該院神經內科病區奇異變形桿菌院內感染狀況與耐藥機制。方法對20株不重復奇異變形桿菌采用PCR法檢測超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素（AmpC）酶、碳青霉烯酶（KPC）和金屬β內酰胺酶（MBLs）耐藥基因并測序；PCR法檢測整合子并測序；脈沖場凝膠電泳法分析菌株間親緣關系；對這20株奇異變形桿菌進行藥敏試驗并分析。結果從這20株奇異變形桿菌中均檢測出TEM-1和CTX-M-14型耐藥基因，10株菌中分離出CMY-2型耐藥基因。從19株菌中擴增出Ⅰ類整合子，分別整合的基因盒有“aac A4+cml A1”，“dfr A12+orf F+aad A2”和“dfr A32+ere A+aad A2”。脈沖場凝膠電泳結果聚類分析20株菌可分為P1～P11的11個PFGE型別，其中P1～P3的12株菌為同一克隆株。20株菌對美羅培南、阿米卡星、氨曲南、頭孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率高。結論該院神經內科病區出現奇異變形桿菌同克隆株的傳播；攜帶的耐藥基因以CTX-M-14和CMY-2型為主；Ⅰ類整合子攜帶率高，耐藥基因盒以“aac A4+cml A1”和“dfr A12+orf F+aad A2”為主；菌株對美羅培南、阿米卡星和氨曲南均為敏感；臨床科室應同樣重視由奇異變形桿菌引起的院內感染，加強感染控制措施。

奇異變形桿菌； 耐藥基因； 整合子； 脈沖場凝膠電泳

奇異變形桿菌為條件致病菌，也是院內感染菌之一。本院2012年12月至2013年2月從神經內科住院患者臨床標本中密集地分離出奇異變形桿菌。為了解本科室住院患者奇異變形桿菌耐藥基因和整合子的分布及它們的親緣關系，筆者對20株不重復菌進行了頭孢菌素（AmpC）酶、超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）、碳青霉烯酶（KPC）和金屬β內酰胺酶（MBLs）等耐藥基因的擴增，進行了整合子的檢測和脈沖場凝膠電泳（PFGE）的分析和藥敏試驗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 分離的20株奇異變形桿菌來自神經內科住院患者標本，包括14例痰液、5例尿液、1例胸腔膿液。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗 采用美國BD公司PhoenixTM100革蘭陰性桿菌復合板條（NMIC/ID-4）進行菌株鑒定及藥敏試驗，依據CLSI M100-S23版文件的標準判讀藥物敏感試驗結果。

1.2.2 細菌基因組模板制備 用OMEGA Bio-Tek公司生產的細菌基因組抽提試劑盒抽提菌株基因組，基因組樣品終體積為50μL。

1.2.3 質粒DNA模板制備 用OMEGA Bio-Tek公司生產的小量質粒抽提試劑盒（Plasmid Mini KitⅠ）抽提菌株質粒，質粒樣品終體積為50μL。

1.2.4 耐藥基因的檢測 采用PCR法，AmpC酶和ESBLs基因的引物合成和擴增條件按文獻［1］進行；KPC和MBLs（IMP、VIM、NDM）基因的引物合成和擴增條件見表1。采用大連寶生物有限公司的TaKaRa TaqTMHot Start Version試劑盒。

1.2.5 整合子的檢測 采用PCR法，在整合子的保守序列中設計引物5′CS：5′-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3′，3′CS：5′-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3′。

1.2.6 PCR產物測序與分析 產物在含0.5 g/mL溴化乙啶的1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，出現目的條帶的判為陽性，切膠回收純化；純化產物委托伯尚生物技術上海有限公司測序；所測序列與GenBank數據庫進行比對以確定基因型。

1.2.7 PFGE 用限制性內切酶SfiⅠ（NEB公司產品）進行酶切。實驗方案參照美國病原菌分子分型監測網絡Pulse Net標準實驗方案進行；用Bionumerics軟件Cluster analysis模塊進行聚類分析。

2 結 果

2.1 耐藥基因檢測 20株菌中均檢測到β-內酰胺酶的TEM-1型和ESBLs的CTX-M-14型基因，從10株菌中檢測到AmpC酶的CMY-2型基因；未檢測到SHV型、KPC和MBLs（IMP、VIM、NDM）基因；部分PCR產物電泳結果見圖1、2。圖

2.2 整合子檢測 19株菌檢測到Ⅰ類整合子；17株菌擴增出的二個可變區中，2 256 bp大小的可變區內含“aac A4+ cml A1”基因盒，1 864 bp大小的可變區內含“dfr A12+orf F+ aad A2”基因盒；2株菌擴增出3 002 bp的可變區，內含“dfr A32 +ereA+aad A2”基因盒；1株菌未擴增出整合子；部分整合子PCR產物電泳結果見圖3。

2.3 藥物試驗 20株分離菌的藥敏試驗結果見表2。

2.4 PFGE及聚類分析 20株菌PFGE后，可見8～14條大小不一的電泳條帶。聚類分析顯示，菌株間條帶相似度為47.013%～100.000%之間；按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為11種型別（PFGE type），記為P1～P11，大部分型別只有1個菌株，P1型包含10個株菌。PFGE聚類分析結果見圖4（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

3 討 論

分析的20株奇異變形桿菌均為產ESBLs菌株，ESBLs的檢出率明顯高于文獻［2-3］報道的16.1%和10.7%，20株菌攜帶的耐藥基因型均為CTX-M-14，與文獻［2］報道的以CTXM-15基因型為主的結果略有差異，但均為CTX-M型耐藥基因；從10株菌中擴增出AmpC酶CMY-2型基因，50%的檢出率明顯高于文獻［4-5］報道的1.4%和0.1%，基因型與文獻［4-6］報道的基因型相同；20株菌中10株菌同時產ESBLs和AmpC酶，產超超廣譜β-內酰胺酶（SSBL）菌的陽性率為50%。本院檢出的奇異變形桿菌的ESBLs基因型以CTX-M型為主，AmpC酶的基因型以CMY型為主。

整合子是細菌中的一種可移動性基因元件，在耐藥基因的水平轉移中起到了至關重要的作用。分析的20株奇異變形桿菌中19株擴增出Ⅰ類整合子，陽性率（95%）明顯高于文獻［7］38.6%的報道。整合的耐藥基因產物可導致奇異變形桿菌對氯霉素、三甲氧芐啶、紅霉素、鏈霉素和壯觀霉素的耐藥。

藥敏試驗結果提示美羅培南、阿米卡星、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢他啶可作為對奇異變形桿菌感染治療的首選用藥或經驗用藥。16株菌對亞胺培南耐藥，與文獻［8］報道的主要因產碳青霉烯酶所致耐藥的原因不同，均未檢出碳青霉烯酶和金屬酶，可能與其他機制有關，有待進一步研究。

按80%的相似度為標準［9］，PFGE聚類分析中的三個PFGE型別的1～12號菌株判為同一菌株來源；通過臨床調查，分離出奇異變形桿菌的這些病患均有住過該病區ICU病房的經歷，而該ICU病房因危重患者多，床位之間的距離未達到一米以上的要求，加之可能的其他感染控制措施的不到位，造成了此次奇異變形桿菌的院內感染。

此次研究結果揭示本院神經內科病區出現奇異變形桿菌的院內感染；均為產ESBLs株，其中SSBL菌占50%，攜帶的耐藥基因型為CTX-M-14和CMY-2；Ⅰ類整合子的攜帶率高達95%；美羅培南、氨曲南、阿米卡星、頭孢他啶和加酶抑制劑的抗菌藥物可作為首選用藥或經驗用藥；本院分離的耐亞胺培南株與KPC和MBLs無關；臨床科室應加強院內感染控制措施的落實，避免或減少院內感染的發生。

［1］ 馮福英，胡望平，楊湘越，等.耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌高產AmPC酶發生率及基因型與耐藥性研究［J］.中華醫院感染學雜志，2006，16（6）：601-604.

［2］ 范建中，董曉勤，王賢軍.奇異變形桿菌耐藥性和超廣譜β-內酰胺酶基因型研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2012，22（2）：378-379.

［3］石蘭峰，鈕博.奇異變形桿菌ESBL和AmpC酶的檢測與耐藥分析［J］.中國廠礦醫學，2009，22（1）：75-76.

［4］ 陳曉莉，徐元宏，黃穎，等.變形桿菌臨床分離株的耐藥性分析及其AmpC酶的檢測［J］.安徽醫科大學學報，2007，42（4）：395-398.

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［7］ 陳奕慧，林紅燕.Ⅰ、Ⅱ類整合子在變形菌屬中的分布及耐藥性研究［J］.中華醫院感染學雜志，2014，24（3）：526-528.

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Study on distribution of drug resistance gene and integron and analysis of genetic relationship of 20 isolates of Proteus mirabilis*

Feng Fuying1，Yang Xiangyue2，Hong Yu1，Zheng Zongfu1，Zhang Wei1，Jiang Jicheng1，Zeng Qi1

（1.Department of Clinical Laboratory，the 476th Hospital of PLA，Fuzhou，Fujian 35002，China；2.Institute of Laboratory Medicine，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command，Fuzhou，Fujian 350025，China）

ObjectiveTo investigate the prevalence and resistance mechanisms of Proteus mirabilis in the ward of neurology department of our hospital.MethodsFor a total of 20 clinic isolates of Proteus mirabilis，PCR were used for the detection of AmpC，ESBLs，KPC and MBLs and then DNA sequencing was performed.The integrons were also detected by using PCR and then sequencing was carried out.The genetic relationship between isolates were detected and analysed by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）.The results of drug sensitivity tests were analysed.ResultsTEM-1 and CTX-M-14 gene were found in all the 20 isolates，the 10 isolates of Proteus mirabilis were also found carrying CMY-2 gene.ClassⅠintegrons were amplified from 19 strains carrying gene cassettes″aac A4+cml A1″，″dfr A12+orf F+aad A2″and″dfr A32+ere A+aad A2″respectively.PFGE analysis revealed that the 20 isolates were grouped into 11 PFGE types P1-P11，the 12 isolates of P1-P3 were same clones.The sensitive rates of the isolates to Meropenem，Amikacin，Aztreonam，Ceftazidime and Tazocin were high.ConclusionNosocomial transmission of the same clone of Proteus mirabilis was appeared in the ward of neurology department of our hospital.The predominance drug-resistance genes were CTX-M-14 andCMY-2.The incidence of carrying classⅠintegrons was high，and the major gene cassettes were″aac A4 +cml A1″and″dfr A12+orf F+aad A2″.The 20 isolates were all sensitive to Meropenem，Amikacin and Aztreonam.Other Clinical departments should also pay attention to the nosocomial infection caused by Proteus mirabilis and strengthen the infection control measures.

Proteus mirabilis； drug resistance gene； integron； pulsed-field gel electrophoresis

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.003

A

1673-4130（2015）17-2461-03

2015-04-14）

南京軍區醫藥衛生科研項目（11 MA118）；南京軍區醫學科學技術研究項目（06MA149）。 作者簡介：馮福英，女，副主任醫師，主要從事臨床微生物學與檢驗的研究。