CNAS－CL36首次修訂主要內(nèi)容解讀

李 波，趙友云，高應(yīng)林

（1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430061）

·檢驗(yàn)科與實(shí)驗(yàn)室管理·

CNAS－CL36首次修訂主要內(nèi)容解讀

李 波1，2，趙友云1，高應(yīng)林1

（1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430061）

分子診斷的基礎(chǔ)是分析樣品中的基因及其表達(dá)產(chǎn)物，所涉及的技術(shù)除基因擴(kuò)增檢驗(yàn)外，還包括雜交試驗(yàn)、核酸電泳分析、DNA測(cè)序、生物芯片等［1］。隨著分子診斷技術(shù)的日益發(fā)展與成熟，各級(jí)醫(yī)院逐步開(kāi)展優(yōu)生優(yōu)育篩查、基因突變、異位與重排等分子遺傳病理的檢測(cè)［1］，在該領(lǐng)域建立公認(rèn)的質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)一直備受關(guān)注［2］。近來(lái)，中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）修訂了2013版《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS－CL36，13版應(yīng)用說(shuō)明）［3］，發(fā)布了即將實(shí)施的2014修訂版《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS－CL36，14版應(yīng)用說(shuō)明）［4］。此次修訂新增《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊(cè)》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》等引用文件，將國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO15189的要求推廣并應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域，為其規(guī)范化管理提供了更具操作性的指導(dǎo)，提高了對(duì)分子診斷檢測(cè)能力獲得認(rèn)可的要求。現(xiàn)將此次修訂的主要內(nèi)容分析如下。

1 結(jié)構(gòu)變化

14版和13版應(yīng)用說(shuō)明分別以2012版和2008版《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（準(zhǔn)則）結(jié)構(gòu)編排為依據(jù)［5－6］，管理要求和技術(shù)要求發(fā)生了相互移動(dòng)或整合，其條款修改明細(xì)對(duì)照見(jiàn)表1。有些修改只是條款發(fā)生改變，要求未變，如表中＊號(hào)標(biāo)記的修改所示。有些條款的要求具有普遍性和通用性，被作為對(duì)整個(gè)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的整體要求在12版準(zhǔn)則中提出，如從4.1.1.3倫理、5.1.5員工培訓(xùn)、5.10.1實(shí)驗(yàn)室信息管理的文件化程序、5.2.2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入控制、5.3.2.7試劑和耗材記錄和5.3.1.4設(shè)備校準(zhǔn)和計(jì)量學(xué)溯源等方面對(duì)患者信息的保密性、實(shí)驗(yàn)室限制進(jìn)入、試劑和耗材管理記錄和定量檢測(cè)項(xiàng)目溯源等提出了更具體的要求，不再在14版應(yīng)用說(shuō)明中贅述。

2 修改的主要內(nèi)容

14版應(yīng)用說(shuō)明在13版的基礎(chǔ)上，加入了分子病理檢測(cè)等有關(guān)要求，在組織管理和技術(shù)要素方面提出了許多新的和更為嚴(yán)格的要求，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。見(jiàn)表1。

2.1 組織和管理責(zé)任 著重強(qiáng)調(diào)了分子診斷的專(zhuān)業(yè)性:要求非獨(dú)立法人單位的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，自獲準(zhǔn)執(zhí)業(yè)之日起，開(kāi)展分子診斷而不是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作至少2年；并且在技術(shù)管理層必須至少有1名副高及以上專(zhuān)業(yè)技術(shù)職務(wù)資格，從事分子診斷而不是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作至少5年。原因是分子診斷和生化及免疫等醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)屬于不同層面的診斷，整體上仍以手工為主，操作繁瑣［2］，管理者需要具有足夠工作經(jīng)驗(yàn)的積累，以能承擔(dān)實(shí)驗(yàn)室的多項(xiàng)職能，保證并提高最終的檢驗(yàn)質(zhì)量，保證建設(shè)和維護(hù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系并持續(xù)改進(jìn)。

2.2 人員 要求簽發(fā)病理報(bào)告的醫(yī)師“應(yīng)至少具有中級(jí)病理學(xué)專(zhuān)業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子病理工作的經(jīng)歷”，刪除了13版4.1.1對(duì)組織和管理的病理學(xué)診斷資質(zhì)要求，使14版應(yīng)用說(shuō)明還適用于未開(kāi)展病理檢驗(yàn)室的相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室。要求從事分子診斷的人員“應(yīng)至少具有2名”，以能滿(mǎn)足日常檢測(cè)工作的需求，履行質(zhì)量管理體系相關(guān)的崗位職責(zé)。

對(duì)新員工的最初2次能力評(píng)審時(shí)限由2個(gè)月放寬為6個(gè)月，對(duì)他們能力的評(píng)估與授權(quán)應(yīng)根據(jù)他們各自的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，自我管理、工作和學(xué)習(xí)熱情與積極主動(dòng)性、適應(yīng)新的工作環(huán)境等方面的綜合能力，對(duì)質(zhì)量體系培訓(xùn)掌握的廣度和深度逐步進(jìn)行，符合因材施教、因需施教的教育實(shí)踐。

2.3 設(shè)施和環(huán)境條件 基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本制備區(qū)和分子病理檢驗(yàn)獨(dú)立的標(biāo)本前處理區(qū)均涉及臨床標(biāo)本的操作，需積極預(yù)防實(shí)驗(yàn)室生物、化學(xué)安全事故，設(shè)備應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)要求［7］，“應(yīng)配置二級(jí)生物安全柜和洗眼器，實(shí)驗(yàn)室附近還應(yīng)備有噴淋裝置”。為防止交叉污染，除了嚴(yán)格分區(qū)操作，各個(gè)工作區(qū)物品專(zhuān)區(qū)專(zhuān)用外，工作結(jié)束后應(yīng)立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔，必要時(shí)進(jìn)行消毒及去污染。

2.4 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、試劑和耗材

2.4.1 設(shè)備 為長(zhǎng)期儲(chǔ)存提取的RNA和待檢RNA樣品［8］，亦便于在出具結(jié)果報(bào)告后復(fù)檢或做附加檢驗(yàn)，RNA的檢測(cè)宜配備－70℃的冷凍設(shè)備。組織標(biāo)本前處理區(qū)應(yīng)配備切片機(jī)、裱片機(jī)、切片刀、電熱恒溫箱等必要的設(shè)備。

2.4.2 設(shè)備校準(zhǔn) 設(shè)備的校準(zhǔn)是計(jì)量溯源的基礎(chǔ)、檢驗(yàn)質(zhì)量保證的前提，是實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的重要保障之一。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按要求定期對(duì)強(qiáng)檢設(shè)備進(jìn)行檢定，對(duì)直接或間接影響檢驗(yàn)結(jié)果的非強(qiáng)檢設(shè)備進(jìn)行外部或內(nèi)部校準(zhǔn)。因此，除應(yīng)定期對(duì)PCR儀、加樣器、溫度計(jì)和恒溫設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)外，還應(yīng)定期對(duì)離心機(jī)和生物安全柜等進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.4.3 試劑和關(guān)鍵耗材的管理 這也是14版應(yīng)用說(shuō)明修訂的重點(diǎn)之一，要求“實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立試劑和關(guān)鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗(yàn)收程序，相應(yīng)程序中應(yīng)有明確的判斷符合性的方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。”通過(guò)觀(guān)察確保包裝的完整性和有效期足夠長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確保試劑的核酸提取效率和核酸擴(kuò)增效率、關(guān)鍵耗材不存在抑制物、試劑的批間差異等符合要求。定量檢測(cè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)可參考附錄A6，即選取覆蓋測(cè)量區(qū)間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值）5個(gè)舊批號(hào)檢測(cè)過(guò)的樣品，采用新批號(hào)試劑或/和耗材復(fù)檢，至少4個(gè)樣品測(cè)量結(jié)果偏倚小于±7.5%，其中陰性和臨界值樣品必須符合預(yù)期。定性檢測(cè)的試劑，選擇陰性和弱陽(yáng)性的樣品進(jìn)行試劑批號(hào)驗(yàn)證。由此可見(jiàn)，每更換一批試劑或關(guān)鍵耗材都要做批號(hào)驗(yàn)證，結(jié)果滿(mǎn)足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方能啟用新試劑或/和關(guān)鍵耗材。若批號(hào)驗(yàn)證結(jié)果不符合要求時(shí)，需要查找原因，如果實(shí)驗(yàn)室懷疑提取試劑有質(zhì)量問(wèn)題，可采取有關(guān)技術(shù)確認(rèn)核酸提取的純度。

2.5 檢驗(yàn)前過(guò)程 由于RNA酶的廣泛存在，RNA在制備過(guò)程中很容易被降解。血漿或組織中及提取好的RNA的穩(wěn)定性受處理方法和儲(chǔ)存條件等影響不一［9－10］。因此，核酸檢測(cè)樣品在分離血漿或提取前后都應(yīng)適當(dāng)儲(chǔ)存。對(duì)于超長(zhǎng)期儲(chǔ)存后的標(biāo)本，在使用前還應(yīng)再次評(píng)估標(biāo)本的完整性。組織樣品應(yīng)采用10%中性緩沖的甲醛固定，固定液的量和固定時(shí)間應(yīng)符合檢測(cè)要求。

2.6 檢驗(yàn)過(guò)程

2.6.1 檢驗(yàn)方法和程序的性能驗(yàn)證 14版提高了檢驗(yàn)方法和程序的性能驗(yàn)證要求，定量檢測(cè)增加了線(xiàn)性和抗干擾能力的驗(yàn)證。可報(bào)告范圍驗(yàn)證的前提是做線(xiàn)性試驗(yàn)，當(dāng)測(cè)量線(xiàn)性范圍足夠?qū)挘€(xiàn)性?xún)?nèi)的測(cè)量范圍即為可報(bào)告范圍。黃疸、溶血、脂血、藥物類(lèi)及常見(jiàn)病原體的交叉反應(yīng)等在多大程度上干擾核酸檢測(cè)，報(bào)道并不一致，有可能跟試劑、方法等有關(guān)。由此可見(jiàn)驗(yàn)證檢測(cè)分析程序抗干擾能力的重要性和必要性。定性檢測(cè)項(xiàng)目也要驗(yàn)證抗干擾能力，準(zhǔn)確度的驗(yàn)證則要求采用方法學(xué)比較或與金標(biāo)準(zhǔn)比較。此外，檢測(cè)應(yīng)使用驗(yàn)證過(guò)的核酸抽提和純化方法，必要時(shí)進(jìn)行核酸定量。所有驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)經(jīng)過(guò)授權(quán)人審核。

2.6.2 產(chǎn)前診斷 胎兒檢驗(yàn)前，應(yīng)在同一實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)雙親的突變狀態(tài)。宜防止母體細(xì)胞污染，采集雙份孕婦標(biāo)本做雙份羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析，在完成診斷前應(yīng)保留備份培養(yǎng)物并跟蹤監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.6.3 原位雜交（ISH） 應(yīng)有明確和統(tǒng)一ISH陽(yáng)性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)，并建立本實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性閾值。組織病理ISH，應(yīng)結(jié)合組織形態(tài)進(jìn)行結(jié)果判讀，并采用國(guó)際通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

2.7 檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的保證

2.7.1 室內(nèi)質(zhì)控 每次實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽(yáng)性和陽(yáng)性質(zhì)控物，質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)要符合確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性和檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性的質(zhì)控規(guī)則；定性檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽(yáng)性和/或陽(yáng)性質(zhì)控物，陰陽(yáng)性要符合預(yù)期。應(yīng)保留DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄。需要時(shí)，選擇內(nèi)標(biāo)以評(píng)價(jià)所提取RNA的完整性，并保留RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄及假陰性率監(jiān)測(cè)記錄。應(yīng)由病理醫(yī)師評(píng)價(jià)用于基因突變檢測(cè)的樣品，并決定是否需要對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集。當(dāng)分子診斷結(jié)果與臨床和其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符時(shí)，應(yīng)記錄并分析原因，適當(dāng)時(shí)采取糾正措施。

2.7.2 能力驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)及替代方案 刪除了替代方案“實(shí)驗(yàn)室以評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果與臨床診斷一致性判斷檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性”。

2.7.3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部比對(duì) 檢測(cè)同一項(xiàng)目且生物參考區(qū)間相同的兩套及以上檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)頻次由每年至少2次改為至少1次，增加檢驗(yàn)人員的比對(duì)與考核，每年至少1次。比對(duì)結(jié)果應(yīng)符合要求。

2.8 檢驗(yàn)后過(guò)程 為便于復(fù)查，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定原始樣品、核酸提取物和/或核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的保存期限。為便于追溯，凝膠圖像和斑點(diǎn)雜交條帶和/或通過(guò)掃描、拍照等方式保留的結(jié)果應(yīng)作為技術(shù)記錄參照相關(guān)行業(yè)要求保存。檢驗(yàn)報(bào)告單作為舉證倒置法律文書(shū)病歷的重要組成部分，門(mén)（急）診類(lèi)保存不少于15年，住院類(lèi)不少于30年［11］。

2.9 結(jié)果報(bào)告 分子診斷和其他檢測(cè)技術(shù)一樣，都有其局限性，如核酸檢測(cè)的檢出限、抗干擾能力，突變基因檢出的特異度等，實(shí)驗(yàn)室需要在此類(lèi)報(bào)告中對(duì)此作出提示［12］，提出進(jìn)一步檢測(cè)的建議，并提供相關(guān)咨詢(xún)服務(wù)的聯(lián)系方式。

3 小 結(jié)

14版應(yīng)用說(shuō)明已與12版準(zhǔn)則一起自2014年11月1日始同步施行。本文從14版對(duì)13版應(yīng)用說(shuō)明的改進(jìn)入手，結(jié)合12版和08版準(zhǔn)則的差別，對(duì)此次修訂的主要內(nèi)容作出了詳細(xì)的解讀，旨在有助于分子診斷領(lǐng)域有關(guān)人員更好地理解和運(yùn)用準(zhǔn)則，提高其質(zhì)量和能力，建立并不斷完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系。

［1］劉永華，陳化禹.分子診斷的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（3）:265－266.

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［3］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS－CL36:2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明［S］.北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2013.

［4］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS－CL36:2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明（修訂版）［S］.北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2014.

［5］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS－CL02:2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則（ISO15189:2012）［S］.北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2012.

［6］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS－CL02:2008醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則（ISO15189:2007）［S］.北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2008.

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