反相高效液相色譜法檢測阿立哌唑血藥濃度

汪旭強，宋保利，楊 娜，周志強，薛斌麗

（天水市第三人民醫(yī)院檢驗科，甘肅天水 741000）

·臨床研究·

反相高效液相色譜法檢測阿立哌唑血藥濃度

汪旭強，宋保利，楊 娜，周志強，薛斌麗

（天水市第三人民醫(yī)院檢驗科，甘肅天水 741000）

目的建立反相高效液相色譜法檢測抗精神病藥阿立哌唑的血藥濃度。方法采用Agilent 1260型高效液相色譜儀及其配套Agilent HC－C18分析柱，以254 nm檢測波長測定阿立哌唑濃度，建立標準曲線，并進行專屬性試驗、精密度試驗及回收試驗，評價高效液相色譜法檢測阿立哌唑血藥濃度的性能。結果高效液相色譜法檢測阿立哌唑的批內精密度（RSD）為4.6%～7.1%、批間RSD為4.1%～8.9%；回收率為94.7%～97.4%；最低檢測限為8.5 ng/m L。線性方程:Y＝4.480 1 X＋43.716（r2＝0.999 6），線性范圍為25～1 000 ng/m L。結論該檢測方法快速、準確，適合臨床藥物治療時血藥濃度的監(jiān)測。

阿立哌唑； 高效液相色譜法； 血藥濃度

阿立哌唑對精神分裂癥的陽性和陰性癥狀均有治療作用，同時由于其錐體外系不良反應（EPS）少、抗膽堿作用輕、對體質量和心電圖校正后QT（QTc）間期無明顯影響，因此成為了抗精神分裂癥的一線治療藥物［1］。筆者建立高效液相色譜法（HPLC）檢測阿立哌唑血藥濃度，旨在用較簡便的測定方法為臨床用藥提供依據，以利于個體化用藥。

1 材料與方法

1.1 標本來源 所有血液標本均來自天水市第三人民醫(yī)院服用阿立哌唑的精神分裂癥患者。

1.2 儀器與試劑 Agilent 1260型高效液相色譜儀及其配套Chemstation B 02版本工作站（美國安捷倫公司）；XW－80A漩渦混合器、AS5150B超聲清洗儀、MTN－2800W氮吹儀及AP01P真空泵，均為天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產；FA1004型電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；－40℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）；25、50 μL微量進樣器、500μL移液槍均為上海安亭微量進樣器廠生產；UPT－Ⅱ－5T優(yōu)普超純水機（成都超純有限科技公司）。阿立哌唑對照品（中國藥品生物制品檢定所），內標奮乃靜（美國藥典參考標準品），甲醇（HPLC/色譜純）、乙醚（HPLC/色譜純）、乙腈（HPLC/色譜純）均為美國天地試劑公司生產，四甲基乙二胺（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、乙酸（分析純）、磷酸氫二銨（分析純）均為國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱采用Agilent HC－C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm，批號USJAB01832），流動相為甲醇300 mL∶60 mmol/L磷酸氫二銨280 m L∶四甲基乙二胺2 m L∶乙酸3 m L∶乙腈480 m L，流速1.0 m L/min，檢測波長254 nm，柱溫為40℃，進樣體積為30μL。

1.3.2 標準液的制備 精密稱取阿立哌唑對照品2 mg，用90%甲醇以超聲儀助溶并定容至10.0 m L，得到200 ng/μL阿立哌唑標準品儲備液，由儲備液配制0.625、1.25、2.5、5.0、12.5、25.0 ng/μL濃度的系列標準應用液；精密稱取奮乃靜內標2 mg，用90%甲醇溶解并定容至10.0 m L，得到200 ng/μL的內標儲備液，再由內標儲備液配制10 ng/μL的內標應用液，所有配制液均密封置于－40℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品處理 取血清0.5 m L，加內標應用液20μL，加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液200μL，加入乙醚5 m L，渦旋混合1 min，靜置30 min，－40℃冷凍60 min，取上清液于尖底離心管，在35℃水浴中氮氣流吹干，100μL流動相復溶，取30μL進樣分析。

1.3.4 標準曲線的建立 于6支抽提管中分別加入空白血清0.5 mL，將系列濃度的阿立哌唑標準應用液分別取出20μL加入各抽提管，各管再加入內標應用液20μL，得到阿立哌唑濃度為25、50、100、200、500、1 000 ng/mL的標準曲線，再依樣品處理程序進行操作；以峰面積（Y）對應其濃度（X）建立標準曲線。

1.3.5 專屬性試驗 通過測定阿立哌唑標準品、空白血清、含阿立哌唑的血清樣品，確認阿立哌唑的專屬色譜圖。

1.3.6 精密度試驗 以空白血清為基礎加入標準應用液，配制理論濃度為200、500、1 000 ng/m L的樣品，按樣品的處理方法操作后，進行色譜分析，依據標準曲線計算濃度，檢測批內精密度（RSD）、批間RSD（n＝5）。

1.3.7 回收試驗 以空白血清為基礎加入標準應用液，配制理論濃度為200、500、1 000 ng/m L的樣品，按樣品的處理方法操作后，進行色譜分析，依據標準曲線計算濃度，檢測回收率（n＝5）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據處理與統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗；以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 標準曲線圖及線性 阿立哌唑標準曲線回歸方程:Y＝4.480 1 X＋43.716（r2＝0.999 6），截距a與0差異無統(tǒng)計學意義（t＝0.041 6，P＞0.05），阿立哌唑血藥濃度在25～1 000 ng/m L范圍內與峰面積之間有良好的線性關系；基于噪音標準偏差和校正曲線斜率之比方法所得的最低檢測限為8.5 ng。阿立哌唑血清濃度標準曲線，見圖1。

2.2 專屬性試驗圖譜 阿立哌唑的保留時間約為7.6 min。阿立哌唑血清濃度測量的專屬性試驗圖譜，見圖2。

2.3 精密度試驗結果 HPLC檢測阿立哌唑血清的批內RSD為4.6%～7.1%，批間RSD為4.1%～8.9%。見表1。

2.4 回收試驗結果 200、500、1 000 ng/m L樣品的回收率分別為95.6%、94.7%和97.4%。見表2。

3 討 論

在HPLC用于阿立哌唑血清濃度檢測的方法建立初期，始終得不到穩(wěn)定的標準品色譜圖。在反復的試驗過程中，阿立哌唑的系列標準液應用色譜圖峰面積與對應濃度不成比例，如標準液濃度為50 ng/mL時其峰面積為80，100 ng/mL時其峰面積為100，500 ng/mL時其峰面積為130，1 000 ng/mL時其峰面積為120，兩者無線性關系，且各濃度的峰面積大小基本一致，均在（100±30）左右。針對以上情況，在研究性試驗時，將系列標準應用液不做萃取處理直接檢測，得到的色譜圖峰面積與各濃度間存在線性關系（Y＝6.350 1 X＋41.252，r＝0.952 3）。通過反復試驗與分析，筆者懷疑萃取所用的乙醚可能存在問題。經過與供貨商的溝通發(fā)現(xiàn)，該乙醚添加了一定量的過氧化氫（H2O2），是適用于環(huán)境質量監(jiān)測的色譜純級試劑，而阿立哌唑對H2O2較敏感，很容易被氧化變性，所以該乙醚不適用于阿立哌唑藥物濃度分析。改用專門用于藥物濃度分析的新乙醚后，本試驗建立了r2＝0.999 6的回歸方程。因此，在實際工作中需要做好乙醚的防氧化工作，把乙醚分裝入棕色小玻璃瓶避光，每次操作打開1瓶，使其盡可能地少與空氣接觸，保持乙醚的新鮮；此外，操作時在120 mL乙醚中加入0.1 mol/L維生素C 5 m L，以消除乙醚中的過氧化物［2］，使對過氧化物敏感的阿立哌唑保持穩(wěn)定的萃取率。

劉偉忠等［3］與何國琪等［4］研究報道，HPLC測定阿立哌唑的出峰時間分別為9.3 min和18.5 min，而本方法的出峰時間為7.6 min左右，適用于臨床快速檢測。另外，藥物濃度分析的質量控制中，實驗方法性能的方法學評價與檢驗醫(yī)學方法學性能的評價略有不同［5］，本文主要根據藥物分析的方法學性能評價進行相關實驗探討。該方法的精密度、回收率均符合要求［5］。

綜上所述，本研究建立的HPLC檢測阿立哌唑血藥濃度的方法快速、準確，能應用于臨床診療活動，可為患者個體化用藥提供科學的參考依據。

［1］左笑叢，劉世坤，朱運貴，等.阿立哌唑的血藥濃度與其治療精神分裂癥療效的相關性分析［J］.中國新藥與臨床雜志，2006，25 （8）:601－605.

［2］李文標，翟屹民，王傳躍.高效液相色譜電化學檢測法測定血清奧氮平濃度［J］.藥物分析雜志，2000，20（5）:304－307.

［3］劉偉忠，黃偉僑，劉文憲，等.RP－HPLC測定人血漿中阿立哌唑的濃度［J］.現(xiàn)代食品與藥品雜志，2006，16（4）:17－19.

［4］何國琪，陳華良.高效液相色譜法測定人血漿中阿立哌唑濃度［J］.中國藥物與臨床，2007，7（7）:543－545.

［5］何俊，潘桂湘，高秀梅.生物藥物分析方法的質量控制［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2007，26（3）:158－159.

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.049

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1673－4130（2015）10－1431－02

2015－03－02）