流式細胞術檢測早期梅毒患者外周血細胞T淋巴細胞亞群

梁 平，李喜英，陳 宏，何曉丹，薛強東，饒 娟

（東莞康華醫院皮膚科，廣東東莞 523080）

流式細胞術檢測早期梅毒患者外周血細胞T淋巴細胞亞群

梁 平，李喜英，陳 宏，何曉丹，薛強東，饒 娟

（東莞康華醫院皮膚科，廣東東莞 523080）

目的通過檢測早期梅毒患者外周血T淋巴細胞亞群，了解機體在梅毒早期感染時的細胞免疫狀況，以指導臨床治療。方法應用流式細胞儀檢測59名志愿者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋淋巴細胞亞群，其中健康對照組20例，一期梅毒（PS）組10例，二期梅毒（SS）組15例，早期潛伏梅毒（ELS）組14例。結果早期梅毒各組CD3＋、CD4＋、CD8＋均高于對照組，CD3＋是SS組最高，PS組次之，ELS組第3，組間差異有統計學意義（P＜0.05），SS組高于對照組且差異有統計學意義（P＜0.05）。CD4＋為ELS組最高，SS組次之，PS組第3，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。CD8＋為PS組最高，SS組次之，ELS組第3，組間差異無統計學意義（P＞0.05），CD4＋/CD8＋差異無統計學意義（P＞0.05）。結論早期梅毒細胞免疫有增強，這對清除TP是非常有利的。

梅毒； 外周血； 細胞免疫

2003年以來，梅毒蔓延態勢迅速，在我國以年均14.3%的比例增加［1］，早期梅毒（一期、二期和早期潛伏）傳染性強，是最重要的傳染源，也是目前防控的重點人群。梅毒螺旋體（TP）的感染初期表現為在入侵部位出現軟骨樣潰瘍面，稱為硬下疳，這是一期梅毒的典型臨床表現。未經治療一期梅毒的潰瘍可“自愈”，但大多數未經治療患者于硬下疳“自愈”6～8周后，會在生殖器周圍出現扁平濕疣和/或出現四肢、軀干等部位的銅紅色斑丘疹，這是二期梅毒的表現，二期梅毒未經治療也可“自愈”，其中30%～40%的患者發展為三期梅毒，表現為心血管和神經系統損害。在這個過程中還可有潛伏梅毒，并且潛伏可以發生在上述過程中的任何階段，機體的細胞免疫功能與病原體的相互作用在疾病的發展和結局中起到了關鍵的作用。研究發現，在接受青霉素的治療者中有35.71%以上失敗，免疫學治療成為提高療效的新方向，體液免疫在梅毒中對TP的應答并不重要，細胞免疫在抗TP中起重要作用。為了解梅毒早期感染時的細胞免疫狀況，本研究應用流式細胞儀對梅毒患者進行外周血T淋巴細胞亞群的檢測，并與健康人群對照，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收入在本院門診就診、體檢或術前檢查的志愿者59名，男38例，女21例，平均（31.9±10.8）歲。

1.2 納入與排除標準 梅毒組:根據病史、臨床表現和血清學檢查綜合診斷的梅毒患者，知情同意，愿意加入本研究中，人免疫缺陷病毒（HIV）抗體陰性并且未使用過激素和抗菌藥物等藥物，無嚴重系統疾患。健康對照組:螺旋體抗原血清試驗陰性、非螺旋體抗原血清試驗和HIV抗體檢測均為陰性，無嚴重系統疾患，自愿加入本研究。排除標準:患有系統性疾、不愿加入本研究，螺旋體試驗或非螺旋體試驗有1項為陰性者。

1.3 方法 FACS Calibur流式細胞儀、淋巴細胞亞群試劑盒、紅細胞裂解液和破膜劑等儀器設備和試劑是由美國BD公司生產。非螺旋體抗原血清試驗所用的是上海榮盛生物藥業有限公司生產的甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）試劑盒；螺旋體抗原血清試驗所用的是日本富士瑞必歐株式會社生產的TP明膠凝集試驗（TPPA）試劑盒，HIV抗體試劑盒是由北京萬泰生物藥業股份有限公司提供。上述各項試驗的操作分別參照各種儀器及試劑說明書，按規程由專人負責進行。

1.4 統計學處理 應用STATA 8.0軟件包進行統計學分析，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多間組比較采用方差分析；計數資料以例數表示，組間比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

對照組20例，男16例，女4例，平均（29.6±6.7）歲，TPPA、TRUST和HIV抗體均為陰性。梅毒組中，一期梅毒（PS組）10例，男6例，女4例，平均（35.0±9.7）歲，其中TPPA陰性2例，TPPA陽性患者滴度1∶320～1∶10 240，中位數1∶2 560，TRUST陰性1例，TRUST陽性患者的滴度1∶8～1∶64，中位數1∶16，HIV抗體均為陰性；二期梅毒（SS組）15例，男10例，女5例，平均（30.3±9.8）歲，TPPA均為陽性，滴度1∶1 280～1∶10 240，中位數1∶2 560，TRUST滴度1∶2～1∶128，中位數1∶32，HIV抗體均為陰性；早期潛伏梅毒（ELS組）14例，男6例，女8例，平均（34.6±16.1）歲，TPPA均為陽性，滴度1∶1 280～1∶10 240，中位數1∶2 560，TRUST滴度1∶4～1∶64，中位數1∶32，HIV抗體均為陰性。對照組與梅毒各亞組間性別和年齡差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

梅毒各亞組CD3＋、CD4＋、CD8＋均高于對照組，CD3＋是SS組最高，PS組次，ELS組第3，組間差異有統計學意義（P＜0.05），兩兩比較SS組高于對照組且差異有統計學意義（P＜0.05）。CD4＋為ELS組最高，SS組次，PS組第3，組間差異有統計學意義（P＜0.05），兩兩比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。CD8＋為PS組最高，SS組次，ELS組第3，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。CD4＋/CD8＋在對照組中最大值為1.92，最小值為0.51；PS組中最大值為3.02，最小值為0.33；SS組中最大值為1.74，最小值為0.51；ELS組中最大值為3.20，最小值為0.84，兩兩比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

3 討 論

本研究中發現PS組有1例TPPA和TRUST均為陰性的患者，但通過病史、臨床表現和隨訪TPPA和TRUST轉陽的結果，確診為PS；并發現另外1例患者TRUST為陽性、TPPA為陰性，也是通過病史、臨床表現和隨訪TPPA和TRUST的結果，確診為PS，可見TRUST轉為陽性先于TPPA。對于PS的診斷，不能單純依靠血清學，病史、臨床表現及隨訪是很重要的。

T細胞以CD3＋作為表面標記，反映細胞免疫功能狀況，按生物學功能分為不同的亞群，各亞群相互作用但又各有其功能，共同完成免疫應答和免疫調節作用。在與顆粒性抗原接觸時產生免疫作用，T淋巴細胞既可作為免疫效應細胞直接殺傷靶細胞，又可作為免疫調節細胞，輔助其他免疫細胞分化和調節免疫應答。T細胞按表型的不同可分為占外周血總淋巴細胞35%～50%的CD4＋細胞和占外周血總淋巴細胞24%～30%的CD8＋細胞兩個細胞亞群，分別代表功能不同的兩個群體。

CD4＋細胞主要是輔助性T淋巴細胞（Th），又可以分為Th1和Th2兩個亞群，TP感染刺激機體淋巴細胞活化形成Th0細胞，并進而向Th1方向極化，Th1分泌白細胞介素－2 （IL－2）和γ－干擾素（IFN－γ）等細胞因子，促進巨噬細胞抑制和殺傷TP，并可抑制Th2的功能，增強細胞免疫。早期梅毒清除機制的關鍵是遲發性超敏反應巨噬細胞的活化，活化的Th1細胞分泌IL－2、IFN－γ等細胞因子上調巨噬細胞的免疫反應，參與反應的巨噬細胞不僅起到呑噬細胞的作用，又能起到抗原提呈細胞的作用，上調T細胞的功能，在機體抗TP感染的過程中發揮著重要作用［2－3］。Th2分泌白細胞介素－4（IL－4）和白細胞介素－10（IL－10）等細胞因子，與B淋巴細胞增殖、成熟和促進抗體生成有關，可增強抗體介導的免疫應答，并可下調Th1對TP的免疫應答。

CD8＋細胞主要介導一些抗病毒和抗真菌感染的細胞免疫反應，抗螺旋體感染的免疫功能可介導TP的清除，但主要是抑制機體免疫反應，在抑制自身反應性CD4＋細胞活性的同時，也可抑制TP制動抗體的產生，降低機體抵抗和清除TP感染的能力，造成TP的繁殖、擴散和梅毒的潛伏。CD8＋細胞可以分為在數量上占多數的抑制性T淋巴細胞（Ts）和占少數的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）兩個亞群，Ts細胞通過轉化生長因子（TGF）、IL－10等細胞因子抑制Th1對TP的免疫應答，Ts增高表明細胞免疫功能受到抑制，CTL通過細胞裂解和細胞凋亡作用介導殺傷TP，而CTL增高則對清除TP有增強作用。

本研究結果表明早期梅毒CD3＋和CD4＋均高于對照，雖然最終只是發現SS組CD3＋高于對照組的統計學意義，可能還在于樣本量的不足，有待今后進一步增大樣本量，但已經初步表明早期梅毒細胞免疫有增強，這對清除TP是非常有利的。

CD4＋/CD8＋綜合了CD4＋和CD8＋兩者的信息，比單獨CD4＋或CD8＋的結果更能反映機體免疫狀況。大多數感染性疾病發生時CD4＋/CD8＋下降，但該比值的下降只能表明存在T細胞免疫功能紊亂，還需要進一步檢查，動態觀察其變化更有意義。本研究中CD4＋/CD8＋最大值在ELS組，最小值在PS組，統計學無異常發現，早期梅毒感染者細胞免疫功能屬正常范圍。由于研究結果采用的是均數，不能很好地反映動態變化，如能根據感染后時間進行相應測定，可能更有利于免疫學改變的解釋，這種動態監測肯定是非常有幫助的。

細胞水平上的認識是有差異的，有學者認為梅毒感染者細胞免疫受抑制，從而認為臨床治療梅毒時加用免疫調節劑可以增強療效［4－5］，盡管目前關于免疫調節治療對梅毒的療效有肯定的一面，但這種應用的結果還有待進一步證實。

事實上在梅毒感染過程中CD4＋、CD8＋和CD4＋/CD8＋既可以升高也可以下降，這應是人體免疫對TP應答的正確表述，即便在HIV感染早期，CD4＋也升高，只在疾病的發展過程中CD4＋的破壞超過合成才出現CD4＋和CD4＋/CD8＋比值的下降。

本研究沒有進行Th1及Th2亞群及其淋巴因子分子水平的檢測，這是基于一期梅毒向二期梅毒的發展過程中始終是Th1優勢這一結論。Fitzgerald［6］綜合多項動物實驗的研究結果，推測在人體一期梅毒向二期梅毒的發展過程中CD4＋亞群從Th1占優勢轉變為Th2占優勢的漂移學說，但同時也發現有充足的實驗數據支持的幾乎完全相矛盾的兩種結果，即人體在TP感染時外周血T淋巴細胞亞群檢測既有升高也有降低。盡管目前仍有學者非常推崇Th1/Th2漂移學說，在較早期的研究中，Van等［7］和Wicher等［8］就完全否認一期梅毒向二期梅毒的發展過程中有Th1亞群向Th2亞群漂移，并認為在一期梅毒向二期梅毒的發展過程中始終是Th1優勢，只有如此才能達到早期梅毒患者的皮疹自行消退和無癥狀潛伏，近期Leader等［9］和李軍等［10］研究再次證實與早期研究結果相一致。

外周血中CD4＋的降低和CD8＋的升高與病情的嚴重程度相關［11］，CD4＋和CD4＋/CD8＋在潛伏梅毒時升高，在一期梅毒向二期梅毒和三期神經梅毒的發展過程中，CD4＋逐步下降而CD8＋逐步升高，但CD4＋始終高于CD8＋，只是在惡性梅毒和嚴重的神經梅毒時，CD4＋明顯下降、CD8＋升高才表現出CD4＋/CD8＋明顯降低。梁平等［12］在觀察一期梅毒患者的研究中表明在硬下疳潰瘍的第一周細胞免疫功能受抑制，第二周時增強。孫莉等［13］研究發現隨血漿反應素環狀卡片試驗（RPR）滴度增高，CD8＋細胞數量升高、CD4＋/CD8＋比值降低。

目前梅毒的免疫學研究不僅是外周血或組織中CD4＋、CD8＋等細胞和Th1、Th2亞群及其細胞因子的水平，而是已經到了腦脊液的Th17和調節性T細胞的層面上［14－15］，這是下一步研究的著眼點。總之，梅毒感染時機體的細胞免疫可能既有抑制也有增強，不能一味地強調梅毒感染者就是免疫抑制，畢竟早期梅毒不經治療只有30%～40%的患者發展為三期梅毒，也就是說大部分患者的確是自愈了，免疫調節劑的應用價值還有待進一步觀察。

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Flow cytometric detection of peripheral blood T lymphocyte subpopulations in patients with early syphilis

Liang Ping，Li Xiying，Chen Hong，He Xiaodan，Xue Qiangdong，Rao Juan
（Department of Dermatology and Venereology，Dongguan Kanghua Hospital，Dongguan，Guangdong 523080，China）

ObjectiveTo detect the lymphocyte subpopulations in patients with early syphilis，so as to know their immunity condition and guide clinical treatment.MethodsFlow cytometry was used to detect CD3＋，CD4＋and CD8＋lymphocyte subpopulations in peripheral blood from 59 volunteers，including 20 normal individuals（Cont group），10 patients with primary syphilis（PS group），15 patients with secondary syphilis（SS group）and 14 patients with early latent syphilis（ELS group）.ResultsCD3＋，CD4＋and CD8＋lymphocyte subpopulations in each syphilis groups were higher than Cont group.SS group had the highest CD3＋level，second was PS group，and third was ELS group.There was significant difference among three groups（P＜0.05）.The CD3＋level of SS group was significantly higher than that of Cont group（P＜0.05）.ELS group had the highest CD4＋level，second was SS group，third was PS group.The difference of CD4＋level was significant among three groups（P＜0.05）.PS group had the highest CD8＋level，second was SS group，third was ELS group.However，the difference of CD8＋level among three groups was not significant（P＞0.05）.There was no significant difference of CD4＋/CD8＋among three groups（P＞0.05）.ConclusionCytoimmunity in early syphilis enhances，which could be benefit to eliminate Treponema Pallidum.

syphilis； peripheral blood； cytoimmunity

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.033

A

1673－4130（2015）10－1395－03

2015－01－15）

梁平，男，副主任醫師，主要從事梅毒臨床和相關基礎研究。