流式細胞儀性能評價方法的建立

王小林，李 昂，楊 碩

（北京大學第三醫院檢驗科，北京 100191）

流式細胞儀性能評價方法的建立

王小林，李 昂，楊 碩

（北京大學第三醫院檢驗科，北京 100191）

目的建立流式細胞儀性能評價方法。方法基于《YY/T0588－2005流式細胞儀》行業標準，利用BriCyte E6流式細胞儀，建立適用于流式細胞儀性能評價的測試方案，包括熒光靈敏度、熒光線性、前向角散射光檢測靈敏度、儀器分辨率、前向角散射光和側向角散射光分辨率、倍體分析線性、攜帶污染率、表面標志物檢測準確性、表面標志物檢測重復性、儀器穩定性等。結果該流式細胞儀各項性能指標均滿足行業標準規定的技術要求。結論上述性能指標測試方法可靠，能夠對流式細胞儀性能進行全面評價。該方法對于流式細胞儀性能驗證有一定的指導意義。

流式細胞儀； 性能評價； BriCyte E6

流式細胞儀主要用于細胞生物學、免疫學等科學研究領域，以及臨床醫學領域，特別是在獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）和腫瘤患者淋巴細胞免疫功能評價、白血病免疫分型及微量殘留病診斷方面，具有不可替代的作用［1－2］。本研究以《YY/T0588－2005流式細胞儀》為依據，建立了流式細胞儀性能評價方案，旨在為流式細胞儀整體性能評價提供詳細、完整的測試方案。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 邁瑞公司BriCyte E6流式細胞儀及配套CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色試劑和溶血劑；Duke公司Duke Standards（3K1000）、Duke Standards（4K－03）標準微球；Spherotech公司Rainbow calibration particles （RCP－30－2）、Rainbow calibration particles（RCP－30－5A）標準微球；BD公司DNA QC Particles標準微球；R＆D公司Status－Flow?Flow Cytometry Control質控品。

1.2 方法

1.2.1 熒光靈敏度 取適量RCP－30－5A標準微球，用1 mL鞘液稀釋混勻后上機檢測，獲取各個峰的平均熒光強度。根據標準微球說明書提供的各個峰的等量可溶性熒光分子數（MESF），按照隨試劑附帶的標準軟件進行統計計算。技術要求:FITC不大于200 MESF，PE不大于100 MESF。

1.2.2 熒光線性 取適量RCP－30－5A標準微球，用1 m L鞘液稀釋混勻后上機檢測，得到各個峰的平均熒光強度。根據標準微球說明書提供的各個峰的MESF，以MESF（Y）和平均熒光強度（X）的線性回歸方程，計算線性相關系數（r）。技術要求:r≥0.98。

1.2.3 前向角散射光（FSC）檢測靈敏度 取1μm 3K1000標準微球，加入裝有1 mL鞘液的試管中，充分混勻后上機檢測，檢查直方圖上顯示的峰值信號及顯示峰值信號的標準微球直徑。技術要求:FSC檢測靈敏度應不大于1μm。

1.2.4 儀器分辨率 將RCP－30－2標準微球稀釋于1 m L磷酸鹽緩沖液（PBS）中，混勻后上機測試，獲取FSC和FL1～6各熒光通道的變異系數（CV）。技術要求:FSC通道CV≤2.0%；FITC、PE通道CV≤2.0%；PerCP、PE－Cy7、APC、APCCy7通道CV≤4.0%。

1.2.5 FSC和側向角散射光（SSC）分辨率 （1）取5μL枸櫞酸鈉抗凝外周血，加入裝有1 m L鞘液的試管中，混勻后上機檢測。技術要求:FSC/SSC圖應能將外周血中的血小板和紅細胞分開。（2）取100μL乙二胺四乙酸抗凝外周血，溶血處理后上機檢測。技術要求:FSC/SSC圖應能將外周血的白細胞三群（淋巴細胞、單核細胞、粒細胞）分開。

1.2.6 倍體分析線性 DNA QC Particles中的小雞紅細胞核（CEN）或小牛胸腺細胞核（CTN）經過碘化丙啶（PI）染色后上機檢測，獲取G2/M期（四倍體細胞峰）與G0/G1期（二倍體細胞峰）平均熒光強度，計算二者比值。技術要求:比值范圍1.95～2.05。

1.2.7 攜帶污染率 取適量4K－03標準微球，用1 m L鞘液稀釋混勻后連續上機測試3次，計算標定區域的顆粒數，分別記為H1～1、H1～2、H1～3。進行一次標本管返沖循環后，再進行空白數量測試，連續測試3次，計算標定區域的顆粒數，分別為L1～1、L1～2、L1～3。按照此程序循環3次，再計算攜帶污染率值Ci），取最大值。

式中:Ci為第i次循環的攜帶污染率，i＝1～3。技術要求:攜帶污染率不大于1%。

1.2.8 表面標志物檢測的準確性 使用CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色試劑對StatusFlow?Flow Cytometry Control質控品進行CD3、CD4、CD8標記，重復5次，測定CD3、CD4、CD8陽性百分比，分別計算平均值。技術要求:結果應在質控品說明書給定的參考范圍內。

1.2.9 表面標志物檢測的重復性 使用CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色試劑對StatusFlow?Flow Cytometry Control質控品進行CD3、CD4、CD8標記，重復測定20次，分別計算CD3、CD4和CD8陽性百分比結果的CV。技術要求:CV≤10%。

1.2.10 儀器穩定性 環境溫度變化不超過設定溫度的5%時，取適量RCP－30－2加入裝有1 m L PBS的試管中，充分混勻后上機檢測，得到標準微球平均熒光強度（FL1）。連續開機8 h后，在流式細胞儀的相同設置條件下重復前述步驟，得到標準微球的平均熒光強度（FL2）。按公式計算FL1、FL2偏差值（B）。

技術要求:在8 h內檢測FSC及所有熒光通道峰值平均熒光強度偏差值不超過±10%。

2 結 果

2.1 熒光靈敏度和熒光線性 FITC通道熒光靈敏度為48 MESF，PE通道熒光靈敏度為50 MESF，二者的r分別為0.997 8、0.997 2，滿足規定的技術要求。

2.2 FSC檢測靈敏度 FSC檢測靈敏度檢測結果見圖1，直方圖上顯示直徑為1μm微球的信號峰，滿足規定的技術要求。

2.3 分辨率 FSC及各熒光通道（FL1～6）的CV分別為1.2%、1.0%、1.5%、2.0%、2.6%、3.2%、2.4%，均滿足規定的技術要求。

2.4 FSC和SSC分辨率 FSC和SSC散點圖可將淋巴細胞、單核細胞、粒細胞分開，也能將血小板和紅細胞分開，滿足規定的技術要求，見圖2。

2.5 倍體分析線性 G2/M期和G0/G1期平均熒光強度分別為527 383.1、266 246.7，比值為1.98，滿足規定的技術要求。

2.6 攜帶污染率 3次檢測的攜帶污染率分別為0.02%、0.04%、0.03%，滿足規定的技術要求。

2.7 表面標志物檢測準確性 質控品CD3、CD4、CD8陽性百分比的平均值均在說明書給定的參考范圍內，滿足規定的技術要求，見表1。

2.8 表面標志物檢測的重復性 質控品CD3、CD4、CD8陽性百分比結果的CV分別為0.83%、1.31%、2.40%，滿足規定的技術要求。

2.9 儀器穩定性 0 h和8 h檢測了FSC及FL1～6熒光通道平均熒光強度，偏差值均滿足規定的技術要求，見表2。

3 討 論

關于流式細胞儀性能的評價，國際上還沒有公認的方法和要求。對于科研領域而言，一般通過考察重復性和熒光靈敏度等指標，即可對儀器性能做出初步評價［1，3－5］，但對于醫學領域來說，僅僅考察重復性和熒光靈敏度是不夠的。流式細胞儀輸出的檢測結果會被用于疾病診治、預后判斷等。因此，除了重復性和熒光靈敏度外，更關注于可能影響檢測結果準確性的性能指標。為此，國家食品藥品監督管理局在2005年發布了醫藥行業標準《YY/T0588－2005流式細胞儀》，對流式細胞儀的評價項目不僅涵蓋了重復性、熒光靈敏度等基本性能，而且增加了表面標志物準確性、表面標志物重復性、攜帶污染率等臨床醫生更為關注的性能指標，并對各項性能指標的技術要求等做了明確的定義［3］。

盡管《YY/T0588－2005流式細胞儀》已經發布多年，但該標準對于儀器分辨率的具體計算方法、對各熒光通道分辨率的技術要求，以及各項評價指標的具體操作步驟描述得不夠詳盡，使得該標準在醫學領域中未能得到廣泛應用。為此，本次評價對分辨率的具體計算方法和對各通道分辨率的技術要求做了細化，對評價的具體操作過程也做了說明，為醫學實驗室評價流式細胞儀的性能提供了一套詳盡的參考方法。

［1］Sack U，Tarnok A.Cellular diagnostics:Basic principles，methods and clinical applications of flow cytometry［M］.Basel:Karger， 2009.

［2］劉艷榮.實用流式細胞術－血液病篇［M］.北京:北京大學醫學出版社，2010.

［3］國家食品藥品監督管理局.YY/T0588－2005流式細胞儀［S］.北京:國家食品藥品監督管理局，2005.

［4］Hoffman R.Standardization，calibration，and control in flow cytometry［M］.NJ，USA:John Wiley ＆Sons，2012.

［5］Shapiro HM.Practical flow cytometry［M］.4th ed.NJ，USA:John Wiley ＆Sons，2003.

Establishment of evaluation methods for the performance of flow cytometer

Wang Xiaolin，Li Ang，Yang Shuo
（Department of Laboratory Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China）

ObjectiveTo Establish evaluation methods for the performance of flow cytometer.MethodsReferring to the industry standard YY/T0588－2005 Flow Cytometry，evaluating methods for the performance of BriCyte E6 flow cytometry was established，such as fluorescence sensitivity，fluorescence linearity，forward scatter sensitivity，instrument resolution，forward scatter/side scattering resolution，DNA content linearity，carry－over rate，accuracy of the cell surface marker，reproducibility of the cell surface marker and instrument stability.ResultsThe performance of BriCyte E6 met the requirements of industry standard.ConclusionThe evaluation methods for the performance parameters could be reliable and could be used for the performance evaluation of flow cytometer.

flow cytometry； performance evaluation； BriCyte E6

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.020

A

1673－4130（2015）10－1366－03

2015－01－07）

王小林，男，副主任技師，主要從事臨床血液及體液檢驗研究。