肺結核患者NO和FOXP3表達水平變化及意義

沈麗燕，申衛紅，朱 嵐

（南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州 215001）

肺結核患者NO和FOXP3表達水平變化及意義

沈麗燕，申衛紅，朱 嵐

（南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州 215001）

目的探討肺結核患者一氧化氮（NO）和叉頭蛋白3（FOXP3）表達水平的變化及臨床意義。方法選擇肺結核患者與健康者各40例，采用Griess比色法檢測血清NO水平，采用流式細胞儀檢測外周血CD4＋CD25＋T淋巴細胞百分比；采用實時定量聚合酶鏈反應檢測FOXP3 mRNA水平。結果肺結核患者血清NO濃度為（15.71±1.26）μmol/L，高于健康者的（5.45± 0.98）μmol/L（P＜0.05）；肺結核患者外周血CD4＋CD25＋T淋巴細胞約占CD4＋T淋巴細胞的（4.57±0.85）%，高于健康者的（1.83±0.49）%（P＜0.05）；肺結核患者外周血CD4＋CD25＋T淋巴細胞高表達FOXP3。結論肺結核患者NO、FOXP3表達水平均升高，在肺結核免疫調節機制中起著重要作用；動態監測二者表達水平的變化有利于肺結核患者的診治。

一氧化氮； 叉頭蛋白3； 肺結核

肺結核是由結核分枝桿菌引發的肺部感染性疾病，與T淋巴細胞介導的細胞免疫反應密切相關，其中調節性T淋巴細胞（Treg）在其中占重要作用［1］。Treg是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細胞，在維持機體免疫自穩、調控免疫應答方面起重要作用，特征性表達轉錄因子叉頭蛋白3（FOXP3）［2－3］。一氧化氮（NO）由具有多種生物學活性，由NO合成酶（NOS）催化合成。NOS可分為基礎型（c NOS）及誘導型（iNOS）。研究發現，結核分枝桿菌感染巨噬細胞后，能誘導NO的產生，從而發揮炎癥介質和細胞毒作用，殺傷結核分枝桿菌［4－5］。為了解NO和FOXP3在肺結核發病機制中的作用，本研究檢測了肺結核患者NO、FOXP3水平，探討二者與肺結核免疫功能紊亂的關系，以期為肺結核的免疫治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年6月至2013年3月在無錫市第三人民醫院呼吸科住院治療的結核病患者40例（實驗組），診斷標準符合《肺結核診斷和治療指南》［6］；男26例、女14例，年齡20～75歲，平均（40.5±11.2）歲。與研究組性別、年齡相匹配的體檢健康者40例納入對照組。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NO檢測 采集受試者晨起空腹靜脈血4 m L，3 000 r/min離心10 min，分離血清標本，采用上海杰美基因醫藥科技有限公司Griess比色法NO檢測試劑盒檢測血清NO水平。

1.2.2 CD4＋CD25＋T淋巴細胞亞群檢測 采集受試者枸櫞酸鈉抗凝靜脈血2 mL，取全血標本100μL，加入PE標記的CD4抗體、FITC標記的CD25抗體（美國BD公司）各10μL，室溫避光孵育30 min；加入紅細胞裂解液（美國BD公司），振蕩混勻；離心后棄上清液，磷酸鹽緩沖液洗滌后混勻，采用FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）計數細胞，以Cellquest軟件分析數據，計算CD4＋CD25＋T淋巴細胞百分比。

1.2.3 FOXP3 m RNA表達的檢測 按照實時定量聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒（德國QIAGEN公司）說明書的要求，提取全血RNA，采用RT－PCR檢測FOXP3 mRNA水平，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參基因。FOXP3擴增上游引物:5′－GAA CGC CAT CCG CCA CAA CCT GA－3′，下游引物:5′－CCC TGC CCC CAC CAC CTC TGC－3′。聚合酶鏈反應（PCR）循環條件:95℃5 min，94℃30 s、69℃30 s、72℃1 min循環30次。反應結束后設定最佳閾值，根據儀器給出的標準曲線和斜率，計算FOXP3相對表達指數。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行數據處理和統計學分析。計量資料以表示，兩組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NO濃度檢測 實驗組、對照組血清NO濃度分別為（15.71±1.26）、（5.45±0.98）μmol/L，實驗組血清NO濃度高于對照組（P＜0.05）。

2.2 CD4＋CD25＋T淋巴細胞亞群檢測 實驗組、對照組外周血CD4＋CD25＋T淋巴細胞在CD4＋T淋巴細胞中所占比例分別為（4.57±0.85）%、（1.83±0.49）%，實驗組高于對照組（P＜0.05）。

2.3 FOXP3 mRNA表達水平檢測 實驗組、對照組FOXP3 m RNA相對表達指數分別為4.42±0.31、2.08±0.26，實驗組FOXP3 mRNA表達水平高于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

肺結核是較為常見的一類傳染病，T淋巴細胞介導的細胞免疫反應和遲發性變態反應對結核病發病、演變及轉歸產生決定性影響。近年來，調控免疫反應的CD4＋CD25＋Treg細胞成為免疫抑制治療的研究焦點。Treg特征性表達轉錄因子FOXP3，后者對CD4＋CD25＋Treg細胞發育及功能具有調控作用［7］。本研究結果表明，肺結核患者CD4＋CD25＋T淋巴細胞的數量明顯高于健康者，提示結核分枝桿菌進入機體后，可在宿主細胞內大量寄生和繁殖，從而誘導T淋巴細胞介導的細胞免疫反應。NO是在NO合成酶（NOS）作用下由L－精氨酸轉化而來。NOS是生成NO的關鍵酶。一方面，在c NOS的作用下，參與血管張力生理性調節過程；另一方面，iNOS激活后可介導血管內皮細胞損傷，產生大量的NO，從而參與免疫病理反應。本研究結果顯示，肺結核患者血清NO水平高于健康者，表明NO水平的變化與肺結核的發生、發展有關，參與肺結核的免疫炎性反應［8－9］。

綜上所述，肺結核患者CD4＋CD25＋T淋巴細胞數量明顯升高，而CD4＋CD25＋T淋巴細胞又高表達FOXP3，說明FOXP3的高表達可能在肺結核發病機制中起重要作用。同時，肺結核患者血清NO水平也明顯升高，表明NO的高表達也參與肺結核的免疫炎性反應。因此，在肺結核的治療中，對NO和FOXP3介導的免疫耐受進行干預十分必要。動態監測NO、FOXP3表達水平的變化，有利于肺結核患者的診治。這為進一步研究NO和FOXP3在肺結核發生、發展機制中的作用奠定了基礎。

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［2］van Mierlo GJD，Scherer HU，Hameetman M，et al.Cutting edge: TNFR－shedding by CD4＋CD25＋regulatory T cells inhibits the induction of inflammatory mediators［J］.J Immunol，2008，180 （5）:2747－2751.

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［4］Jonna I，Mekonnen M，Abate E，et al.Resistance to first－line anti－TB drugs is associated with reduced nitric oxide susceptibility in Mycobacterium tuberculosis［J］.PLoS One，2012，7（6）:891－896.

［5］Martin IV，Bartek IL，Visconti K，et al.The response of mycobacterium tuberculosis to reactive oxygen and nitrogen species［J］.Front Microbiol，2011，2（2）:105－109.

［6］中華醫學會結核病學分會.肺結核診斷和治療指南［J］.中華結核和呼吸雜志，2001，24（1）:70－73.

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［9］Niedbala W，Cai B，Liu H，et al.Nitric oxide induces CD4＋CD25＋Foxp3 regulatory T cells from CD4＋CD25 T cells via p53，IL－2，and OX40［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（39）:5478－5483.

Study of NO and FOXP3 in patients with pulmonary tuberculosis

Shen Liyan，Shen Weihong，Zhu Lan
（Nanjing Medical University Affiliated Suzhou Hospital/Suzhou Municipal Hospital，Suzhou，Jiangsu 215001，China）

ObjectiveTo Study the expressions and significance of nitric oxide（NO）and forkhead box protein 3（FOXP3）in patients with pulmonary tuberculosis.MethodsSerum NO levels were measured by Griess colorimetric reaction.Flow cytometry was used to determine the number of CD4＋CD25＋T cells in peripheral blood.The expression of FOXP3 m RNA was measured by real－time polymerase chain reaction.ResultsSerum NO level in patients was（15.71±1.26）μmol/L，higher than the（5.45± 0.98）μmol/L of healthy controls（P＜0.05）.CD4＋CD25＋T cells comprised（4.57±0.85）%of CD4＋T cells in patients，higher than the（1.83±0.49）%in healthy controls（P＜0.05）.CD4＋CD25＋T cells in the peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis highly expressed FOXP3.ConclusionPatients with pulmonary tuberculosis could be with an increased level of NO and FOXP3，which might have important role in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis.

nitric oxide； forkhead box protein 3； pulmonary tuberculosis

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.019

A

1673－4130（2015）10－1364－02

2015－02－08）

沈麗燕，女，檢驗師，主要從事臨床免疫學檢驗研究。