HBV感染者調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子研究＊

顏曉霞，陳錫蓮，李彩東，吳 斌，段正軍，田鵬飛

（1.蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅蘭州 730046；2.蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所，甘肅蘭州 730046）

HBV感染者調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子研究＊

顏曉霞1，陳錫蓮2△，李彩東2，吳 斌2，段正軍2，田鵬飛2

（1.蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅蘭州 730046；2.蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所，甘肅蘭州 730046）

目的探討乙型肝炎病毒（HBV）e抗原（HBe Ag）陽性及陰性HBV感染者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）、白細(xì)胞介素－18、γ－干擾素、轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)水平及臨床意義。方法將175例HBV感染患者分為慢性乙型肝炎（CHB）組和慢性無癥狀HBV攜帶者（ASC）組，各組再分為HBe Ag（＋）組和HBe Ag（－）組，檢測外周血CD4＋CD25＋Treg、細(xì)胞因子及肝功能指標(biāo)的水平。以健康者作為對照組。結(jié)果HBeAg（＋）與HBeAg（－）ASC組和CHB組CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HBe Ag（＋）與HBe Ag（－）ASC組和CHB組細(xì)胞因子表達(dá)水平較對照組明顯升高（P＜0.05）；HBeAg（＋）ASC組外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)基酶/血小板比值呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論CD4＋CD25＋Treg和細(xì)胞因子在乙型肝炎慢性化過程中起重要作用；CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與肝炎的炎性反應(yīng)程度有一定關(guān)系。

乙型病毒性肝炎； 調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞； 細(xì)胞因子； 乙肝e抗原

乙型肝炎病毒（HBV）感染機(jī)體后，并不直接引起肝細(xì)胞損傷，而是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞及部分細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)間接損傷肝細(xì)胞［1］。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）是具有自身免疫功能和免疫抑制性的CD4＋T淋巴細(xì)胞亞群，通過抑制CD8＋T淋巴細(xì)胞的增殖及活化，調(diào)控機(jī)體對HBV的免疫應(yīng)答［2］。輔助性T淋巴細(xì)胞（Th細(xì)胞）產(chǎn)生的Th1/Th2型細(xì)胞因子有可能參與了慢性乙型肝炎（CHB）的發(fā)病機(jī)制。Th1型細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素－18（IL－18）、γ－干擾素（IFN－γ）等，Th2型細(xì)胞因子有轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）、白細(xì)胞介素－10（IL－10）等［3］。本研究旨在探討HBV e抗原（HBe Ag）陽性［HBeAg（＋）］與HBe Ag（－）慢性HBV感染者CD4＋CD25＋Treg、IL－18、IFN－γ、TGF－β表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年7～12月在蘭州市第二人民醫(yī)院就診的HBV感染者175例，男95例、女性80例，年齡11～66歲，平均（39.38±12.72）歲，符合《慢性乙型肝炎診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；所有患者均未接受免疫調(diào)節(jié)和抗病毒治療，6個月內(nèi)未接受保肝治療，排除甲、丙、丁、戊等肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎等疾病。175例患者中，CHB患者63例（CHB組），其中HBe Ag（＋）30例，HBeAg（－）33例；慢性無癥狀HBV攜帶者（ASC）112例（ASC組），其中HBe Ag（＋）24例，HBe Ag（－）88例。同期體檢健康者50例納入對照組，男25例、女25例，年齡23～58歲，平均（38.68±13.01）歲。

1.2 方法

1.2.1 CD4＋CD25＋Treg檢測 采集受試者乙二胺四乙酸二鉀抗凝空腹外周血2 m L，取50μL抗凝血，加入20μL單抗（CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP），振蕩混勻，室溫避光孵育20min；加入2 m L溶血素，振蕩混勻，室溫避光放置15 min；1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加入2 m L磷酸鹽緩沖液（PBS），1 500 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)一次；加入500μL PBS，采用美國BD公司流式細(xì)胞儀、配套試劑進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記物檢測，采用FAC Suite軟件獲取和分析熒光參數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測 采集受試者外周血，常規(guī)方法分離血清標(biāo)本，采用美國RD公司酶聯(lián)免疫法試劑盒及科華公司ST－360酶標(biāo)儀進(jìn)行IL－18、IFN－γ、TGF－β檢測。操作步驟參照試劑盒及儀器說明書。

1.2.3 外周血其他指標(biāo)檢測 采集受試者外周血，常規(guī)方法分離血清標(biāo)本，采用美國貝克曼公司AU－680全自動生化分析儀及配套試劑進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）檢測。常規(guī)方法進(jìn)行血小板（PLT）檢測。操作步驟參照試劑盒及儀器說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD4＋CD25＋Treg、細(xì)胞因子檢測結(jié)果 （1）HBe Ag（＋）和HBe Ag（－）ASC患者外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），IL－18、IFN－γ及TGF－β水平則明顯升高（P＜0.05），見表1。（2）HBe Ag（＋）與HBe Ag（－）CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平變與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），IL－18、IFN－γ及TGF－β水平則明顯升高（P＜0.05），但HBe Ag（＋）與HBe Ag（－）組間IL－18、IFN－γ和TGF－β水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.2 CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與肝功能相關(guān)性分析 （1）HBeAg（＋）ASC組外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與ALT、AST/PLT（A/P）呈正相關(guān)（P＜0.05）；HBe Ag（－）ASC組外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與ALT、AST、TBIL、A/P均無相關(guān)性（P＞0.05），見表3。（2）HBe Ag（＋）及HBeAg（－）CHB組外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與ALT、AST、TBIL、A/P均無相關(guān)性（P＞0.05），見表4。

表1 ASC患者、健康者外周血CD4＋CD25＋Treg、細(xì)胞因子檢測結(jié)果（）

＊:P＜0.05，與對照組比較。

組別n CD4＋CD25＋Treg（%）IL－18（ng/m L）IFN－γ（ng/m L）TGF－β（ng/m L）HBeAg（＋）24 26.18±15.86 590.39±80.98＊190.92±55.49＊359.43±76.19＊HBe Ag（－）88 28.72±13.06 506.56±91.68＊208.75±48.89＊329.63±67.82＊對照組50 27.30±14.59 49.79±14.68 14.41±4.75 42.28±13.50

表2 CHB患者、健康者外周血CD4＋CD25＋Treg、細(xì)胞因子檢測結(jié)果（）

＊:P＜0.05，與對照組比較。

組別n CD4＋CD25＋Treg（%）IL－18（ng/m L）IFN－γ（ng/m L）TGF－β（ng/m L）HBe Ag（＋）30 30.48±19.12 425.67±83.47＊177.91±28.13＊315.69±70.95＊HBeAg（－）33 31.42±18.58 469.27±77.89＊202.76±29.65＊345.33±62.28＊對照組50 27.30±17.59 49.79±15.68 14.41±8.75 42.28±13.50

表3 ASC患者外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與肝功能相關(guān)性（）

＊:與HBe Ag（＋）患者CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)；#:與HBe Ag（－）患者CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)；－:無數(shù)據(jù)。

組別n ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）A/P HBe Ag（＋）24 29.12±7.57 33.50±23.42 17.08±8.44 1.68±1.62 HBeAg（－）88 25.52±9.46 31.82±12.55 30.75±69.69 0.52±0.60 r －0.49＊0.11#0.03＊0.05#－0.08＊－0.14#1.00＊0.07#P－＜0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05

表4 CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與肝功能相關(guān)性（）

＊:與HBe Ag（＋）患者CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)；#:與HBe Ag（－）患者CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)；－:無數(shù)據(jù)。

組別n ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）A/P HBe Ag（＋）30 366.70±95.94 318.93±82.45 71.09±44.55 3.31±2.63 HBeAg（－）33 180.94±59.16 111.64±59.24 61.09±34.94 1.32±1.01 r －0.12＊0.33#0.17＊0.30#0.09＊0.14#0.01＊0.02#P－＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

3 討 論

CHB發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為宿主免疫調(diào)節(jié)紊亂是其發(fā)病及病理損傷的主要原因［5］。在免疫反應(yīng)過程中，各種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答，形成免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，是宿主抵御病毒感染的重要因素。

CD4＋CD25＋Treg是具有免疫抑制功能的抑制性T淋巴細(xì)胞群［6］，在健康者體內(nèi)，生理性CD4＋CD25＋Treg約占CD4＋T淋巴細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，以免疫負(fù)向調(diào)節(jié)的方式抑制自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的作用，對多種刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)，對于維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)及免疫耐受具有重要作用，可通過非抗原特異性方式抑制免疫系統(tǒng)的功能，但具體的作用機(jī)制尚不完全清楚［7］。Stoop等［8］發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg數(shù)量較健康者增多，去除CD4＋CD25＋Treg后，HBV特異性增殖反應(yīng)增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，HBe Ag（＋）與HBeAg（－）ASC患者和HBe Ag（＋）與HBeAg（－）CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。同時，HBe Ag（＋）與HBeAg（－）CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平較健康者有升高趨勢，提示CD4＋CD25＋Treg可通過抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖，調(diào)控機(jī)體對HBV感染的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)，促進(jìn)病毒的清除。

細(xì)胞因子作為宿主產(chǎn)生的重要炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)介質(zhì)，在清除HBV的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用。Th1/Th2型細(xì)胞因子具有相互調(diào)節(jié)、相互制約的作用，共同調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)。正常情況下，Th1/Th2處于動態(tài)平衡狀態(tài)，如果Th1/Th2失衡，可能導(dǎo)致免疫功能紊亂，影響免疫防御功能。與健康者相比，HBeAg（＋）與HBe Ag（－）ASC患者和HBe Ag（＋）與HBe Ag（－）CHB患者外周血IL－18、IFN－γ及TGF－β水平明顯升高（P＜0.05），提示IL－18、IFN－γ及TGF－β可能參與了CHB的發(fā)病過程，與何登明等［9］的報道一致。此外，HBe Ag（＋）ASC患者外周血TGF－β水平高于HBeAg（－）ASC患者，原因可能是TGF－β表達(dá)增加，促進(jìn)受損肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞對PLT的聚集作用，進(jìn)而釋放更多的TGF－β。

關(guān)于CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與ALT水平的關(guān)系，Lin等［10］認(rèn)為肝細(xì)胞損傷可增強(qiáng)CHB患者CD4＋CD25＋Treg的抑制活性，其研究顯示，外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與ALT水平呈正比，去除CD4＋CD25＋Treg后，ALT水平較高的患者HBV特異性CD8＋T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)明顯高于ALT水平較低的患者。但國內(nèi)有研究顯示，外周血CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與血清ALT水平無相關(guān)性［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg（＋）ASC患者CD4＋CD25＋Treg與A/P呈正相關(guān)（P＜0.05），提示ASC患者體內(nèi)HBV的增殖激活了細(xì)胞免疫，通過攻擊自身被感染了HBV的肝細(xì)胞，引起肝細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為ALT、AST、TBIL、A/P升高，而長期的慢性炎癥導(dǎo)致肝細(xì)胞不斷被破壞與修復(fù)，逐漸出現(xiàn)肝纖維化，進(jìn)而可能發(fā)展為肝硬化和肝癌。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBe Ag（＋）ASC患者CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與外周血ALT水平呈正相關(guān)（P＜0.05），說明CD4＋CD25＋Treg表達(dá)水平與肝炎的炎性反應(yīng)程度有一定關(guān)系，CD4＋CD25＋Treg對免疫穩(wěn)態(tài)具有重要的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，各種T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的作用不是相互孤立的，而是協(xié)調(diào)、有序的整體，構(gòu)成統(tǒng)一的網(wǎng)絡(luò)，相互協(xié)調(diào)又相互拮抗，保護(hù)機(jī)體，抵抗侵襲，維持正常的免疫應(yīng)答。因此，監(jiān)測IL－18、IFN－γ、TGF－β水平的變化在判斷CHB患者病毒復(fù)制活躍程度、病情進(jìn)展、預(yù)后及指導(dǎo)治療方面具有一定意義。

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Research of Treg and cytokines in patients with hepatitis B virus infection＊

Yan Xiaoxia1，Chen Xilian2△，Li Caidong2，Wu Bin2，Duan Zhengjun2，Tian Pengfei2
（1.Pulmonary Hospital，Lanzhou，Gansu 730046，China；2.Liver Diseases Research Institute，Lanzhou Municipal Second People′s Hospital，Lanzhou，Gansu 730046，China）

ObjectiveTo investigate the value and clinical significance of CD4＋CD25＋regulatory T cells（Treg），inteleukin－18，interferon－γand transforming growth factor－βin patients with hepatitis B virus（HBV）infection.MethodsA total of 175 patients with HBV infection were divided into chronic type B hepatitis（CHB）group and chronic asympotomatic HBV carrier（ASC）group，which were further divided into hepatitis B e antigen（HBe Ag）positive and negative groups.CD4＋CD25＋Treg，cytokines levels and liver function were measured.Healthy subjects were enrolled into control group.ResultsProportion of CD4＋CD25＋Treg were without significant difference among healthy controls，HBe Ag（＋）and HBe Ag（－）ASC groups，and HBe Ag（＋）and HBe Ag（－）CHB groups（P＞0.05）.Compared with control group，cytokines levels were significant higer in CHB and ASC group（P＜0.05）.CD4＋CD25＋Treg level was significant positive correlation to alanine aminotransferase and ratio of aspartate aminotransferase to plateles in HBeAg（＋）ASC group（P＜0.05）.ConclusionCD4＋CD25＋Treg and related cytokines could play important roles in the course of CHB，while CD4＋CD25＋Treg expressing might be correlated with inflammatory degree of hepatitis.

viral hepatitis type B； T regulatory cells； cytokines； hepatitis B e antigen

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.011

A

1673－4130（2015）10－1346－03

2015－03－02）

甘肅省蘭州市科技局科技發(fā)展指導(dǎo)性計劃項目（2013－ZD－06）。 作者簡介:顏曉霞，女，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科研究。△

，Email:tracychen2006＠126.com。