甲狀腺及乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達及其啟動子甲基化狀態分析

于進堂，刁力，李君平，徐世晨

(青島大學醫學院附屬醫院海陽分院內分泌科，山東 海陽 265100)

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甲狀腺及乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達及其啟動子甲基化狀態分析

于進堂，刁力，李君平，徐世晨

(青島大學醫學院附屬醫院海陽分院內分泌科，山東 海陽 265100)

目的 探討甲狀腺、乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達及其啟動子的甲基化狀態。方法 采用RT-PCR及甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測33例甲狀腺、乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達及其啟動子甲基化狀態，以30例單純甲狀腺乳頭狀癌和20例甲狀腺良性病變組織作為對照。結果 多原發癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織和甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的表達缺失率分別為51.5%(17/33)、36.7%(11/30)、15.0%(3/20)，3組比較差異有統計學意義(χ2=7.105，P<0.05)。多原發癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織WIF-1基因的甲基化率分別為45%(15/33)、43%(13/30)，高于甲狀腺良性病變組織的10%(2/20)，差異有顯著性(χ2=6.349、7.185，P<0.01),但多原發癌病人甲狀腺癌組織與單純甲狀腺乳頭狀癌組織相比差異無顯著性(P>0.05)。結論 WIF-1基因mRNA表達缺失在甲狀腺、乳房多原發癌的發生過程中起關鍵作用；WIF-1基因啟動子區的高甲基化狀態可能是其mRNA低表達的機制之一。

腫瘤,多原發性；甲狀腺腫瘤；乳房腫瘤；WIF-1；DNA甲基化

多原發癌是指同一器官或不同器官同時或先后發生兩種或兩種以上的原發性惡性腫瘤。導致多原發癌的原因是多方面的，其中宿主易感性與腫瘤的發生有著密切的關系，抑癌基因的突變可導致原癌基因變成致癌基因，引起癌細胞的生長繁殖。很多研究趨向于多原發癌源于相同的致癌基因，而抑癌基因啟動子區高甲基化狀態是沉默抑癌基因的重要表觀遺傳學機制，可促進腫瘤的發生和發展，成為目前抑癌基因的研究熱點之一[1-2]。抑癌基因WIF-1基因啟動子區甲基化后，其表達降低，對Wnt信號通路的抑制作用減弱，可誘發腫瘤。已有多項調查揭示了甲狀腺惡性腫瘤與乳癌之間可能存在某種聯系[3-5]。但到目前為止，兩者間有無聯系、通過何種途徑發生聯系尚無明確的結論。本研究以單純甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性病變組織為對照，通過檢測甲狀腺、乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達及甲基化狀態，旨在闡明其與多原發癌發生的可能關系。

1 材料和方法

1.1標本來源

收集青島大學附屬醫院2007—2011年間33例甲狀腺、乳房多原發癌病人的甲狀腺癌組織(均為石蠟切塊)，30例單純甲狀腺乳頭狀癌病人甲狀腺癌組織(石蠟切塊10例，新鮮組織20例)，20例甲狀腺良性病變組織(均為新鮮組織)。新鮮組織切除后，液氮保存。

1.2方法

1.2.1DNA、RNA提取 應用氨-氯仿抽提方法從組織中提取DNA，按試劑盒(博日公司)的操作方法從組織中提取RNA。

1.2.2RT-PCR 按TaKaRa DRR037A試劑盒說明進行逆轉錄。引物由上海生工生物工程有限公司合成。WIF-1上游引物序列為5′-TCGTTAAAGCCT-GTCTGC-3′，下游引物序列為5′-CCTTTTATTGCAGTGTCTTCCA-3′，產物長度111 bp;β-actin上游引物序列為5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-CA-3′，下游引物序列為5′-CATCTCTTGCTCGAA-GTCCA-3′，產物長度318 bp。PCR擴增反應體系為25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并分析產物，凝膠成像自動分析系統觀察結果。

1.2.3亞硫酸氨鹽修飾DNA 將2 μg DNA和5.5 μL新鮮配制的 NaOH(3 mol/L)加入50 μL反應體系中，42 ℃水浴30 min，再加入10 mmol/L氫醌30 μL和3.6 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，50 ℃避光水浴16 h。利用DNA純化試劑盒(Promega公司)純化修飾過的DNA，加入5.5 μL NaOH，37 ℃水浴15 min，加入10 mol/L乙酸銨33 μL和冰無水乙醇270 μL沉淀過夜(-20 ℃)，離心，沉淀經體積分數0.70乙醇洗滌后，重溶于去離子水中待用。

1.2.4甲基化特異性PCR(MSP) 以亞硫酸氫鹽修飾的DNA為模板進行擴增。甲基化和未甲基化的WIF-1基因啟動子引物由上海生工生物工程有限公司合成。MSP-M上游引物序列為5′-GGGCCTTT-TATTGGGCGTAT-3′，下游引物序列為5′-AAAC-CAACAATCAACGAAC-3′，產物長度198 bp；MSP-U上游引物序列為5′-GGGTGTTTTATTGGGT-GTAT-3′，下游引物序列為5′-TCCTAAATACAA-ACTCTCCTC-3′，產物長度為198 bp。反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像自動分析系統觀察結果。結果判定：利用甲基化引物能擴增出產物、未甲基化引物不能擴增出產物為完全甲基化，相反情況為完全未甲基化，兩者都能擴增出產物為部分甲基化。

1.2.5統計學方法 采用SPSS 18.0軟件包進行數據分析，Bonferroni法比較3組基因表達缺失有無差異，若有差異，采用分割法進行兩兩比較。3組比較時α=0.05，兩兩比較時α′=0.0167。

2 結 果

2.1WIF-1基因mRNA表達

多原發癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織和甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的表達缺失率分別為51.5%(17/33)、36.7%(11/30)和15.0%(3/20)，3組間比較差異有統計學意義(χ2=7.105，P<0.05)。多原發癌病人甲狀腺癌組織中WIF-1基因mRNA的表達缺失率顯著高于甲狀腺良性病變組織(χ2=7.067，P<0.01)。見圖1。

2.2WIF-1基因啟動子甲基化狀態

多原發癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織和甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的甲基化率分別為45%(15/33)、43%(13/30)、10%(2/20)，3組比較差異有統計學意義(χ2=7.834，P<0.05)。組間兩兩比較，多原發癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織WIF-1基因的甲基化率明顯高于甲狀腺良性病變組織，差異有顯著性(χ2=6.349、7.185，P<0.01)；而多原發癌病人甲狀腺癌組織與單純甲狀腺乳頭狀癌組織相比差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

M:DNA Marker；①、③、⑤、⑦為甲狀腺、乳房多原發癌組織；②、④、⑥、⑧為單純甲狀腺乳頭狀癌組織；⑨為甲狀腺良性病變組織；H2O：空白對照。

圖1 WIF-1基因mRNA表達電泳結果

P：陽性對照；T：甲狀腺、乳房多原發癌組織；N：單純甲狀腺乳頭狀癌組織；B：甲狀腺良性病變組織；H2O：空白對照；U：未甲基化DNA；M：甲基化DNA。

圖2 WIF-1基因mRNA甲基化檢測結果

2.3WIF-1基因表達與其甲基化發生的關系

在WIF-1 mRNA表達缺失的17例甲狀腺、乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織中，12例發生了甲基化，而在16例WIF-1 mRNA表達陽性的組織中，僅3例發生了甲基化；11例WIF-1 mRNA表達缺失的單純甲狀腺乳頭狀癌組織中，共有9例發生了甲基化，而表達陽性的19例中，僅3例發生了甲基化；在3例WIF-1 mRNA表達缺失的甲狀腺良性病變組織中有2例檢測出WIF-1基因啟動子區甲基化，其余17例WIF-1 mRNA表達陽性的組織未檢出甲基化。WIF-1 mRNA的表達與其甲基化的發生有密切聯系(χ2=4.043，P<0.05)。

3 討 論

Wnt信號通路參與調控細胞增殖與分化等活動，其基因表達異常可誘發腫瘤發生。WIF-1基因位于人染色體的12q14.3，其編碼的蛋白為保守型分泌性WIF-1蛋白，該蛋白能抑制Wnt的活性。啟動子區域CpG島的甲基化可使WIF-1基因所編碼的WIF-1蛋白下調或缺失，從而不能阻斷Wnt信號通路，致核內靶基因活化，促進腫瘤的發生發展。在多種腫瘤細胞株和組織中均發現WIF-1基因下調并伴有啟動子甲基化[6-8]。

本文的結果顯示，多原發癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織、甲狀腺良性病變組織中WIF-1基因的表達缺失率差異有顯著性。提示甲狀腺、乳房多原發癌的發生可能與WIF-1 mRNA的表達缺失密切相關。MSP檢測結果顯示，甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的甲基化率明顯低于多原發癌和單純甲狀腺癌組織，盡管甲狀腺、乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因甲基化率較單純甲狀腺乳頭狀癌組織高，但差異無統計學意義。推測WIF-1基因啟動子區異常甲基化可能是引起其mRNA低表達的機制之一。盡管甲狀腺、乳房多原發癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因甲基化率較單純甲狀腺乳頭狀癌組織高，但差異無顯著性，而兩者mRNA表達差異有顯著性。原因可能為：WIF-1基因mRNA表達受到多種因素的調控，高甲基化狀態只是其低表達的機制之一；標本數量有限。

綜上所述，甲狀腺癌(包括甲狀腺、乳房多原發癌和單純甲狀腺乳頭狀癌)的發生可能與WIF-1基因mRNA的低表達有密切聯系，而WIF-1基因啟動子區高甲基化可能是其低表達的機制之一。

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(本文編輯 馬偉平)

mRNA EXPRESSION AND PROMOTER METHYLATION OF WIF-1 GENE IN THYROID CANCER TISSUES OF PATIENTS WITH MULTIPLE PRIMARY CARCINOMAS OF BREAST AND THYROID

YUJintang,DIAOLi,LIJunping,XUShichen

(Department of Endocrinology, Haiyang Hospital, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Haiyang 265100, China)

ObjectiveTo investigate mRNA expression and the promoter methylation of WIF-1 gene in thyroid cancer tissue of patients with multiple primary carcinoma of thyroid (MPCT) and breast.MethodsThe mRNA expression and the promoter methylation of WIF-1 gene in 33 cases of thyroid cancer tissues in patients with multiple primary breast cancer (MPBC) and MPCT were analyzed by reverse transcription PCR (RT-PCR) and methylation specific PCR, and 30 cases of simple papillary thyroid carcinoma (SPTC) tissues and 20 cases of benign thyroid (BT) tissues served as controls.ResultsThe gene deletion rates of WIF-1 expressions in MPCT, SPTC and BT were 51.5% (17/33), 36.7% (11/30) and 15.0% (3/20), respectively, the diffe-rence between the three groups being significant (χ2=7.105,P<0.05). Methylation of WIF-1 gene in MPCT and SPTC was 45% (15/33) and 43% (13/30), respectively, which were higher than 10% (2/20) of BT, the difference being significant (χ2=6.349,7.185;P<0.01), but there was no significant difference between MPCT and SPTC (P>0.05).ConclusionThe absence of WIF-1 gene mRNA expression plays a key role in the process of the occurrence of multiple primary carcinomas in breast and thyroid. The promoter hypermethylation of WIF-1 gene is likely to be one of the mechanisms of low expression of its mRNA.

neoplasms, multiple primary; thyroid neoplasms; breast neoplasms; WIF-1; DNA methylation

2014-06-23;

2014-10-21

于進堂(1965-)，男，副主任醫師。

R736.1

A

1008-0341(2015)02-0144-03