高遷移率族蛋白1在小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的分布及表達

肖湖南，劉宏斌，侯聰聰，于 茜

解放軍總醫院 南樓心血管內科，北京 100853

高遷移率族蛋白1在小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的分布及表達

肖湖南，劉宏斌，侯聰聰，于 茜

解放軍總醫院 南樓心血管內科，北京 100853

目的研究高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)在正常小鼠及高脂喂養的ApoE-/-小鼠主動脈及動脈粥樣硬化斑塊中分布及其在動脈粥樣硬化不同時期的表達。方法8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠12只以及C57BL/6 ApoE-/-雄性小鼠12只分別作為對照組及實驗組，每組分為兩個亞組，早中期組(10周高脂飲食)及晚期組(20周高脂飲食)。10周、20周時處死小鼠，主動脈竇冷凍切片用于油紅O染色評估斑塊大小，巨噬細胞免疫組化染色用于定位巨噬細胞；主動脈竇石蠟切片用于HMGB1免疫組化染色檢測HMGB1表達。結果HMGB1在正常小鼠主動脈中主要表達于內皮細胞胞核，在ApoE-/-小鼠主動脈動脈粥樣硬化斑塊中主要表達于內皮細胞、巨噬細胞胞核及細胞質，平滑肌細胞胞核亦有少量表達；早中期動脈粥樣硬化HMGB1的表達高于晚期動脈粥樣硬化HMBG1的表達(0.05±0.067 vs 0.02±0.053)；晚期動脈粥樣硬化斑塊面積比高于早中期動脈粥樣硬化斑塊面積比(0.40±0.03 vs 0.25±0.02)；巨噬細胞分布于內膜下，是斑塊的主要成分。結論HMGB1在動脈粥樣硬化斑塊中主要表達于內皮細胞、巨噬細胞；早中期HMGB1的表達高于晚期。

高遷移率族蛋白1；動脈粥樣硬化；炎癥

近些年，在膿毒癥等危重醫學研究領域發現高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)作為晚期炎性因子參與炎癥反應，中和HMGB1可明顯抑制炎癥反應及動物模型的死亡率[1]。多種炎性因子(TNF-α、IL-1等)能作用于炎癥細胞，刺激其釋放HMGB1[2]。目前認為，HMGB1在炎癥進展過程中，存在著炎癥瀑布反應，對多種疾病如膿毒癥、自身免疫性疾病、腫瘤等均有促進疾病發展的作用[3]。HMGB1有兩個主要功能：一是作為核蛋白，穩定核小體及DNA，促進轉錄；二是由壞死細胞釋放或者炎癥細胞(如巨噬細胞、NK細胞)分泌，具有觸發炎癥的功能[1,3]。細胞外的HMGB1主要通過與細胞的RAGE、TLR4、TLR2等受體作用激活炎癥通路，可以促進巨噬細胞、樹突狀細胞等炎癥細胞分泌炎性因子(TNF-α、IL-β、IL-6等)[3-5]。HMGB1對血管細胞的影響主要是刺激平滑肌細胞的遷移和增殖、活化內皮細胞、誘導巨噬細胞的侵入以及促進樹突狀細胞的成熟[6]。在動脈粥樣硬化斑塊進展中，HMGB1與斑塊中的炎癥反應密切相關[7-8]。研究HMGB1在小鼠主動脈及動脈粥樣硬化斑塊中的分布及其在不同時期的表達能夠更加明確HMGB1在斑塊進展中的作用。本研究通過對正常小鼠及動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈進行免疫組化分析，研究HMGB1在小鼠主動脈及動脈粥樣硬化斑塊中分布。

材料和方法

1 材料與試劑 兔抗小鼠HMGB1抗體(Boster Bioengineering Company Limited，Wuhan，China)；兔免疫組化檢測試劑盒(CWBIO，China)；大鼠抗小鼠巨噬細胞抗體MOMA-2(Bio-Rad AbD Serotec，Oxford，UK)；大鼠免疫組化檢測試劑盒(Beijing Zhong Shan Golden Bridge Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing，China)；DAB顯色試劑盒(TIANGEN BIOTECH，BEIJING，CO，LTD)；改良油紅O染色試劑盒(Beijing Leagene Biotech.CO，Ltd)。

2 實驗動物及分組 8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠12只，C57BL/6 ApoE-/-雄性小鼠12只，C57BL/6小鼠平均體質量為(25±2) g，ApoE-/-小鼠平均體質量為(25±1) g，均購自南京君科生物科技有限公司(BetterBiotechnology Co，Ltd.)。對照組為正常飲食的C57BL/6小鼠；實驗組為高脂喂養的ApoE-/-小鼠，分為兩個亞組，早中期組(10周高脂飲食)及晚期組(20周高脂飲食)。飼養于IVC環境，高脂飲食(21%豬油脂肪，0.15%膽固醇，南京君科生物科技有限公司)，12 h光照周期。自由飲水，室溫為(23±2)℃，濕度50%±5%。

3 油紅O染色檢測斑塊大小 分別于10周高脂飲食、20周高脂飲食后，用致死劑量的戊巴比妥鈉處死小鼠，胸腹聯合解剖，心臟直視下取血；左心室PBS緩沖液沖洗循環系統，主動脈根部剪斷主動脈，為了分析斑塊大小，主動脈竇連續冷凍切片(6μm thick)從主動脈瓣出現開始收集，每隔10張切片取1張，每只小鼠取5張。切片用改良油紅O試劑盒染色，蘇木素復染。斑塊區域的面積評估采用Image Pro Plus version 6 (Media Cybernetics，Bethesda，MD)分析，以斑塊占動脈管腔橫截面的面積比來表示斑塊相對大小。

4 HMGB1免疫組化 主動脈竇冷凍切片后，將剩余組織于4%多聚甲醛固定24 h，脫水并石蠟包埋，連續石蠟切片(4μm thick)，每間隔10張收集1張，每只小鼠共5張。石蠟切片常規脫蠟置水，檸檬酸鈉緩沖液98℃，20 min抗原修復。PBS充分淋洗后，3% H2O2封閉內源性過氧化氫酶10 min，PBS充分淋洗后，山羊血清封閉10 min，兔抗小鼠HMGB1抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜。PBS充分淋洗后，二抗(山羊抗兔)孵育10 min，PBS充分淋洗后，三抗孵育10 min，PBS充分淋洗后，DAB鏡下顯色，適時終止顯色，蘇木素復染，脫水后中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察、拍照。Image Pro Plus version 6對其進行定量分析。

5 巨噬細胞免疫組化 采用冷凍切片，切片經PBS淋洗后，0.1% Trition孵育透膜15 min，PBS充分淋洗后，3% H2O2封閉內源性過氧化氫酶10 min，PBS充分淋洗后，山羊血清封閉10min，MOMA-2，巨噬細胞特異性抗體(1∶50稀釋)4℃孵育過夜。PBS充分淋洗后，二抗(山羊抗大鼠)孵育10 min，PBS充分淋洗后，三抗孵育10 min，PBS充分淋洗后，DAB鏡下顯色，適時終止顯色，蘇木素復染，脫水后中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察、拍照。

6 統計學處理 所得數據均用SPSS19.0統計軟件處理，數據用表示，組間資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HMGB1在小鼠主動脈及動脈粥樣硬化斑塊中的表達 HMGB1表達在正常小鼠主動脈中，主要表達在內皮細胞胞核。在ApoE-/-小鼠主動脈中，廣泛表達于內膜及內膜下，平滑肌細胞胞核亦有少量表達(圖1)。

2 HMGB1在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中不同時期的表達 ApoE-/-小鼠早中期動脈粥樣硬化斑塊(10周)HMGB1的表達要比晚期(20周) HMBG1的表達含量高(圖2)。定量分析動脈粥樣硬化早中期斑塊內HMGB1表達平均光密度為0.050±0.067，動脈粥樣硬化晚期斑塊內HMGB1表達平均光密度為0.020±0.053，兩者差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊大小及斑塊內巨噬細胞分布 早中期斑塊面積比為0.25±0.02，晚期斑塊面積比0.40±0.03，兩者差異有統計學意義(P＜0.05)。巨噬細胞分布于內膜下，是斑塊的主要成分(圖3)。

討 論

本研究利用免疫組化方法對HMGB1在小鼠主動脈中分布進行研究，并聯合巨噬細胞染色，探討HMGB1與斑塊內內炎癥的相關性。研究發現，正常小鼠中HMGB1主要表達于內皮細胞細胞核，結合既往研究，正常組織中HMGB1作為核蛋白穩定DNA結構，當內皮細胞受損時，可釋放HMGB1作為炎癥介質，增加黏附因子VCAM-1等的表達，從而使炎癥細胞黏附并遷移進入內膜下[4,9-10]。在Kanellakis等[11]的研究中，對高脂喂養ApoE-/-小鼠主動脈竇行冷凍切片進行HMGB1免疫組化染色時，發現HMGB1廣泛分布于內膜中。我們采用石蠟切片，更好地保持了組織的抗原性及結構，清晰地展示了HMGB1在動脈粥樣硬化斑塊內重點分布于內皮細胞。與HMGB1對內皮細胞功能影響的研究一致[9]，證實HMGB1可能參與斑塊形成進展時內皮細胞功能的調控。而且，我們在中膜平滑肌細胞中也發現了少量HMGB1的表達，為HMGB1對平滑肌細胞功能調控提供了證據。

圖 1 HMGB1在小鼠主動脈中表達A：對照組中，HMGB1主要表達內皮細胞細胞核； B：實驗組中，廣泛表達于內膜及內膜下，平滑肌細胞胞核亦有少量表達Fig. 1 HMGB1 expression in aorta of mice A: HMGB1 in aorta of normal mice mainly expressed in the endothelial cells nucleus; B: HMGB1 in aorta atherosclerotic plaques of ApoE-/- mice mainly expressed in nucleus and cytoplasm of endothelial cells and macrophages, and also a small amount smooth muscle cell nuclei

圖 2 HMGB1在動脈粥樣硬化不同時期表達 A：動脈粥樣硬化早期； B：動脈粥樣硬化晚期； C：HMGB1在斑塊內的定量分析，每組n=6Fig. 2 HMGB1 expression at different stages of atherosclerosis A: HMGB1 expression at early and medial stage of atherosclerosis; B: HMGB1 expression at late stage of atherosclerosis; C: Quantitative of HMGB1 expression at different stages of atherosclerosis. 6 in each group

圖 3 ApoE-/-小鼠不同時期主動脈斑塊大小及巨噬細胞分布A：早中期斑塊； B：晚期斑塊； C：早中期斑塊內巨噬細胞； D：晚期斑塊內巨噬細胞； E：不同時期斑塊大小對比，每組n=6Fig. 3 Aortic plaque size and distribution of macrophages of ApoE-/- mice at different atherosclerosis stages A: Aortic plaque size at early and medial atherosclerosis stage; B: Aortic plaque size at late atherosclerosis stage; C: Macrophages distribution at early and medial atherosclerosis stage; D: Macrophages distribution at late atherosclerosis stage; E: Comparison of relative area of AS lesion. 6 in each group

我們的研究發現，早中期斑塊的HMGB1表達要比晚期斑塊稍強。對斑塊HMGB1免疫組化分析可以發現，HMGB1主要集中表達在內皮細胞及內皮細胞下巨噬細胞、泡沫細胞中；而膽固醇結晶附近脂核中心，HMGB1表達并不高。我們猜測，在斑塊早中期，斑塊內泡沫細胞含量多[12]，這個時候表達了大量HMGB1，促進斑塊進一步形成。在斑塊晚期，由于泡沫細胞大量壞死，形成了大脂核壞死中心[13]，故其在晚期表達水平不如早中期。從免疫組化中亦可發現，斑塊晚期的HMGB1仍然主要集中在內皮細胞及內皮下細胞。正是大量泡沫細胞凋亡壞死，釋放出大量HMGB1，與炎癥細胞本身分泌的HMGB1一起啟動了HMGB1介導的炎癥反應，加重了斑塊進展[6]。

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Distribution and expression of high mobility group box 1 in atherosclerotic plaques of mice

XIAO Hu'nan, LIU Hongbin, HOU Congcong, YU Qian
Department of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Corresponding author: LIU Hongbin． Email: liuhbin301@sohu．com

ObjectiveTo study the distribution of high mobility group box 1 (HMGB1) in aorta of normal mice and aorta atherosclerotic plaque of high fat fed ApoE-/-mice and its expression in atherosclerosis at different stages．MethodsTwelve 8-weekold SPF C57BL/6 male mice and twelve C57BL/6 ApoE-/-male mice were used as control group and experimental group, each group was divided into two subgroups, the early and medial stage group (10 weeks high fat diet) and late stage group (20 weeks high fat diet)． After feeding for 10 weeks and 20 weeks, the mice were sacrificed． Aortic sinus frozen sections for oil red O staining was used to assess plaque size, macrophage immunohistochemical staining for localization of macrophages and aortic sinus paraffin sections for immunohistochemical staining to detect the expression of HMGB1．ResultsHMGB1 in normal mice aorta mainly expressed in endothelial cells nucleus, while in aorta atherosclerotic plaques of ApoE-/-mice it mainly expressed in nucleus and cytoplasm of endothelial cells and macrophages, and also a small amount in smooth muscle cell nuclei; HMGB1 expression in early and medial stage atherosclerosis was higher than advanced atherosclerosis (0．05±0．067 vs 0．02±0．053)． Atherosclerotic plaque area ratio in advanced stage was higher than early stage (0．40±0．03 vs 0．25±0．02)． Macrophages were located in the intima, as the main component of plaque．ConclusionHMGB1 in atherosclerotic plaques mainly expresses in endothelial cells and macrophages; The expression of HMGB1 in atherosclerosis is higher in early and medial stage than advanced stage．

high mobility group box 1; atherosclerosis; inflammation

R 543

A

2095-5227(2015)12-1236-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.020

時間：2015-09-24 09:48:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150924.0948.006.html

2015-05-27

肖湖南，男，在讀碩士。研究方向：心血管疾病的診治及預防。Email: xiaohunan0804@163.com

劉宏斌，男，主任醫師。Email: liuhbin301@sohu.com