金雀異黃素對(duì)兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治實(shí)驗(yàn)

張玉玲，吳秀娟，趙 平

1河北省唐山市人民醫(yī)院 眼科，河北唐山 063000；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 眼科，河北石家莊 050000

金雀異黃素對(duì)兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治實(shí)驗(yàn)

張玉玲1，吳秀娟1，趙 平2

1河北省唐山市人民醫(yī)院 眼科，河北唐山 063000；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 眼科，河北石家莊 050000

目的探討金雀異黃素對(duì)兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治作用。方法24只健康新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組、模型組(自血+ 0.1 ml 0.9%氯化鈉注射液)和實(shí)驗(yàn)組(自血+ 0.1 ml 40 mg/L金雀異黃素)。用裂隙燈顯微鏡、眼底鏡觀察玻璃體視網(wǎng)膜的增生情況。術(shù)后第28天采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血小板源性生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子在玻璃體腔內(nèi)的含量，并用HE染色法在光鏡下觀察各組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果術(shù)后第14天模型組及實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜增生程度分別為2.54%、0.69%，第21天為3.00%、0.93%，第28天為3.13%、1.06%，實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜增生程度均顯著低于模型組(P＜0.05)。術(shù)后第28天空白組、模型組及實(shí)驗(yàn)組血小板源性生長(zhǎng)因子含量分別為(79.29±24.77) pg/ml、(349.98±67.36) pg/ml、(180.45± 38.99) pg/ml，表皮生長(zhǎng)因子含量分別為(0.192±0.385)μg/L、(1.215±0.087)μg/L、(0.367±0.06)μg/L，實(shí)驗(yàn)組和空白組的血小板源性生長(zhǎng)因子和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量均顯著低于模型組(P＜0.01)。結(jié)論玻璃體腔內(nèi)注射金雀異黃素對(duì)玻璃體視網(wǎng)膜的增生有明顯抑制作用。

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變；金雀異黃素；血小板源性生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子

金雀異黃素是酪氨酸激酶抑制劑，而酪氨酸激酶在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中起著重要作用[1]。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)受體具有酪氨酸激酶的特性，金雀異黃素可以通過(guò)抑制生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶而抑制生長(zhǎng)因子發(fā)揮生物學(xué)作用，而這兩種生長(zhǎng)因子在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy， PVR)的發(fā)展過(guò)程中有著重要作用。因此，金雀異黃素對(duì)PVR的發(fā)生、發(fā)展可能具有防治作用。本實(shí)驗(yàn)將40 mg/L金雀異黃素注射到兔眼玻璃體腔內(nèi)，觀察不同時(shí)期玻璃體視網(wǎng)膜的變化，定量檢測(cè)玻璃體腔內(nèi)血小板源性生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子含量并用光鏡觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的改變，探討金雀異黃素對(duì)PVR的防治效果。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量1.8 ～ 2.0 kg，左眼為實(shí)驗(yàn)眼，隨機(jī)分為3組。空白組：不做任何處理；模型組：玻璃體腔內(nèi)注射0.1ml自血+ 0.1 ml 0.9%氯化鈉注射液；實(shí)驗(yàn)組：0.1 ml自血+ 0.1 ml 40 mg/L金雀異黃素(華北制藥廠)。

2 模型制作 16只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左眼用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，檢查瞳孔充分散大，2.5%硫噴妥鈉溶液，按70 mg/kg的劑量，肌內(nèi)注射，麻醉滿(mǎn)意后用鹽酸丙美卡因滴眼液角膜表面麻醉，0.9%氯化鈉注射液充分沖洗結(jié)膜囊，1 ml注射器前房穿刺，放出0.2 ml房水；于顳上方距角膜緣后4 mm處向玻璃體中心方向進(jìn)針3 ～ 5 mm，直視下將實(shí)驗(yàn)藥物注射到玻璃體腔中央；用另一個(gè)1 ml注射器從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳緣靜脈抽取自血0.1 ml，用同樣的方法行玻璃體腔內(nèi)注射，拔針后立刻壓迫針孔防止血液和藥物反流。

3 視網(wǎng)膜增生評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后第1、3、7、14、21、28天充分散大左眼瞳孔，裂隙燈顯微鏡和直接檢眼鏡觀察并記錄傷口、前房、晶狀體及玻璃體視網(wǎng)膜增生情況，按Weiss評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)玻璃體視網(wǎng)膜的增生情況進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)：無(wú)增生；0.5級(jí)：玻璃體腔內(nèi)勉強(qiáng)可見(jiàn)增生痕跡；1級(jí)：可見(jiàn)細(xì)小增生束，但無(wú)真正條索形成；2級(jí)：濃厚增生束形成；3級(jí)：細(xì)薄增生條索；4級(jí)：濃厚增生條索[2]。

4 玻璃體視網(wǎng)膜觀察 術(shù)后第1、3、7、14、21、28天用裂隙燈顯微鏡、眼底鏡觀察玻璃體視網(wǎng)膜的改變，并按Weiss評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄。

5 玻璃體PDGF和EGF檢測(cè) 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于造模后第28天充分散大瞳孔，采用耳緣靜脈注射空氣的方法處死，于角膜緣后4 mm處從不同的鐘點(diǎn)位用7號(hào)針頭從玻璃體腔內(nèi)抽取玻璃體液0.5 ml兩份，儲(chǔ)存于-20℃冰箱內(nèi)待測(cè)。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(試劑盒上海貝西公司進(jìn)口分裝)檢測(cè)玻璃體液中PDGF和EGF的含量。

6 視網(wǎng)膜組織觀察 術(shù)后第28天抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物玻璃體后，立即摘除眼球，去除角膜和晶狀體，取距視盤(pán)顳側(cè)2PD的視網(wǎng)膜組織，大小為10 mm×10 mm，固定于10%甲醛溶液中，用HE染色法在光鏡下觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。

圖 2 視網(wǎng)膜組織染色(HE染色×200) A：空白組； B：模型組； C：實(shí)驗(yàn)組Fig. 2 HE staining of retinal tissue (HE×200) A: blank group; B: model group; C: experiment group

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組玻璃體視網(wǎng)膜的增生程度隨時(shí)間的變化情況用曲線圖表示。用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)PDGF和EGF的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。秩和檢驗(yàn)用于PVR分級(jí)情況的比較。

結(jié) 果

1 各組視網(wǎng)膜增生情況比較 空白組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中玻璃體腔透明，均未見(jiàn)混濁及增生。模型組和實(shí)驗(yàn)組玻璃體視網(wǎng)膜的增生均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，但實(shí)驗(yàn)組較模型組明顯緩慢，且增生程度明顯輕于模型組。見(jiàn)圖1。

圖 1 視網(wǎng)膜增生隨時(shí)間變化情況Fig. 1 Time-elapsed conditions of proliferative in retina

2 PVR分級(jí)比較 術(shù)后第14天，PVR平均分級(jí)實(shí)驗(yàn)組為0.69，模型組為2.54；術(shù)后第21、28天實(shí)驗(yàn)組玻璃體視網(wǎng)膜的增生程度較模型組顯著低；術(shù)后第28天實(shí)驗(yàn)組PVR嚴(yán)重程度明顯低于模型組；以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

3 玻璃體液中PDGF和EGF的含量 造模后第28天，實(shí)驗(yàn)組及模型組玻璃體中PDGF和EGF的含量均較正常組升高(P＜0.01或P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組中PDGF和EGF的含量均顯著低于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

4 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查 空白組各層組織結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)水腫及細(xì)胞數(shù)量變化，玻璃體透明，未見(jiàn)滲出、出血及纖維增殖膜形成。模型組神經(jīng)纖維層局部性水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，玻璃體腔中有少量滲出和出血，濃厚的增生條索。實(shí)驗(yàn)組：各層組織結(jié)構(gòu)稍紊亂，細(xì)胞排列整齊，局部神經(jīng)纖維層水腫，少許滲出物附于內(nèi)界膜上。見(jiàn)圖2。

表1 術(shù)后第28天各組 PVR分級(jí)Tab. 1 PVR stages in each group on the 28 th day after operation

表2 玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF含量表達(dá)比較Tab. 2 Comparison of PDGF and EGF concentration in vitreous ()

表2 玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF含量表達(dá)比較Tab. 2 Comparison of PDGF and EGF concentration in vitreous ()

aP＜0.05,bP＜0.01, vs blank group;cP＜0.05,dP＜0.01, vs model group

討 論

金雀異黃素是生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，特別對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體和血小板源性生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶的有明顯抑制作用，通過(guò)抑制酪氨酸激酶的活性抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻止病變發(fā)展[1,3]。血小板源性生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子在PVR發(fā)展過(guò)程中有著極為重要的作用[4-6]。

血小板源性生長(zhǎng)因子由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，發(fā)揮生理學(xué)作用主要是通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合。在PVR增生膜上可檢測(cè)到PDGF及其受體，當(dāng)PDGF和PDGFR結(jié)合后通過(guò)酪氨酸激酶啟動(dòng)細(xì)胞增殖信號(hào)，細(xì)胞開(kāi)始增生，PVR發(fā)展，且發(fā)展程度與PDGF的濃度具有相關(guān)性[7-8]。因此，應(yīng)用激酶抑制劑阻斷PDGFR信號(hào)通路，可阻止PVR的發(fā)展[9]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，實(shí)驗(yàn)組玻璃體腔內(nèi)PDGF含量較模型組均顯著降低，且玻璃體視網(wǎng)膜增生程度較模型組也明顯降低。

表皮生長(zhǎng)因子具有刺激細(xì)胞增生和分化的能力，其發(fā)揮作用需與相應(yīng)的受體結(jié)合。表皮生長(zhǎng)因子受體屬于PTK受體[10]。在視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithepithelium，RPE)細(xì)胞上可檢測(cè)到EGFR的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞因子的刺激激活，EGFR促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖、遷移，加速PVR的發(fā)展[11]。研究表明，應(yīng)用EGFR阻斷劑可以阻止視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遷移，減輕PVR[12]。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看到，實(shí)驗(yàn)組玻璃體腔內(nèi)EGF含量較模型組均顯著降低，而且從玻璃體視網(wǎng)膜增生變化曲線看，實(shí)驗(yàn)組增生程度進(jìn)展緩慢，增生程度減輕。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是PVR增生膜主要的細(xì)胞成分，在PVR的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為細(xì)胞的脫落、移行和增生，并可轉(zhuǎn)化為其他細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子，細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)參與RPE細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，提高RPE細(xì)胞自身反應(yīng)性，加速PVR的發(fā)生和發(fā)展[13-15]。

金雀異黃素可以抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生，誘導(dǎo)其凋亡，并可抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，而且抑制增生、誘導(dǎo)凋亡的作用具有劑量依賴(lài)性，濃度越高其抑制作用越明顯，對(duì)視網(wǎng)膜毒性也越顯著，研究證實(shí)眼內(nèi)注入40 mg/L是安全的，對(duì)視網(wǎng)膜無(wú)明顯毒性反應(yīng)[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組及實(shí)驗(yàn)組中玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF含量均明顯高于正常對(duì)照組，表明這兩種細(xì)胞因子參與了PVR的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)組玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF含量較模型組均顯著降低，證實(shí)金雀異黃素能夠降低玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF的含量。金雀異黃素抑制了細(xì)胞的增生，從而使其自分泌或旁分泌的細(xì)胞因子相應(yīng)減少，這可能是實(shí)驗(yàn)組玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF低于模型組的原因。玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞因子含量的降低，使細(xì)胞增生、遷移減弱，從而阻止了PVR的發(fā)展。術(shù)后7 ～ 14 d為PVR的增生期，此期間由于各種生長(zhǎng)因子的大量分泌，導(dǎo)致視網(wǎng)膜前和玻璃體腔內(nèi)有大量細(xì)胞增生，玻璃體視網(wǎng)膜增生程度加劇。從模型組玻璃體視網(wǎng)膜增生變化曲線看，7 ～ 14 d玻璃體視網(wǎng)膜增生程度顯著加劇，大多數(shù)眼出現(xiàn)纖維增生條索，隨增生過(guò)程進(jìn)展，增生條索漸粗大。而實(shí)驗(yàn)組玻璃體視網(wǎng)膜增生程度相對(duì)緩和，在觀察時(shí)間內(nèi)未見(jiàn)明顯增生條索。對(duì)取材視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜增生程度明顯輕于模型組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此濃度的金雀異黃素能有效抑制實(shí)驗(yàn)性PVR的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果表明，金雀異黃素具有防治PVR的作用，其可能作用機(jī)制：1)金雀異黃素抑制了酪氨酸激酶受體，阻斷了PDGF和EGF與其相應(yīng)的受體結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移的作用，從而抑制了PVR的發(fā)生、發(fā)展；2)金雀異黃素抑制了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生，從而減少了RPE細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，細(xì)胞因子的減少反過(guò)來(lái)使RPE細(xì)胞遷移、增生減輕，從而中斷了PVR的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減輕了病變。因此，金雀異黃素可經(jīng)過(guò)多條途徑，在PVR的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。

綜上，金雀異黃素能夠通過(guò)降低玻璃體腔內(nèi)PDGF和EGF的含量，降低玻璃體視網(wǎng)膜增生的程度。因此，金雀異黃素有望成為玻璃體腔內(nèi)的填充物，用于防治PVR。

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Protective effect of genistein on proliferative vitreoretinopathy

ZHANG Yuling1, WU Xiujuan1, ZHAO Ping2
1Department of Ophthalmology, Tangshan City People's Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China;2Department of Ophthalmology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

ZHAO Ping． Email: zhpsjz@126．com

ObjectiveTo investigate the preventing effect of genistein on proliferative vitreoretinopathy．MethodsTwentyfour healthy New Zealand white rabbits were selected randomly and divided into three groups: blank group, model group (blood therapy+0．9% sodium chloride accouting for 0．1 ml) and experimental group (blood therapy+40 mg/L genistein accounting for 0．1 ml)． Changes in vitreous body and retina were observed with silt lamp microscope and funduscope． The eyes were enucleated to make samples for optical microscope for observing pathological changes of the retina by HE staining on the 28th day after injection of drug． The content of platelet-derived growth factor (PDGF) and epidermal growth factor (EGF) was measured by ELISA． Results Hyperplasia level of vitreous and retina in experiment group was significantly lower than model group on the 14th, 21th and 28th day (0．69% vs 2．54%; 0．93% vs 3．00%; 1．06% vs 3．13%; P＜0．05)． The contents of PDGF and EGF in experiment group were significantly lower than model group and blank group [(180．45±38．99) pg/ml and (79．29±24．77) pg/ml vs (349．98±67．36) pg/ml; (1．215±0．087) μg/L and (0．192±0．385) μg/L vs (0．367±0．06) μg/L, P＜0．05]．ConclusionIntravitreal injection of genistein has obvious inhibitory to proliferative vitreoretinopathy (PVR)．

proliferative vitreoretinopathy; genistein; platelet-derived growth factor; epidermal growth factor

R 774.1；R 776.4

A

2095-5227(2015)12-1232-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.019

時(shí)間：2015-10-21 09:46:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151021.0946.006.html

2015-06-15

張玉玲，女，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：眼科學(xué)。Email: xiaoke-happy@126.com

趙平，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。Email: zhpsjz@ 126.com