抗CD133/CD3雙特異性抗體介導的細胞因子誘導殺傷細胞體外殺傷CD133陽性腫瘤細胞研究

呂海燕，劉傳杰，黃建華，韓為東

解放軍總醫院 基礎醫學研究所免疫研究室，北京 100853

抗CD133/CD3雙特異性抗體介導的細胞因子誘導殺傷細胞體外殺傷CD133陽性腫瘤細胞研究

呂海燕，劉傳杰，黃建華，韓為東

解放軍總醫院 基礎醫學研究所免疫研究室，北京 100853

目的比較抗CD133/CD3雙特異性抗體介導的細胞因子誘導殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK)與普通CIK對胰腺癌、胃癌和卵巢癌等細胞系的殺傷作用。方法利用雜交瘤技術制備鼠抗人CD133單克隆抗體，用酶聯免疫吸附(ELISA)方法檢測腹水效價；經過蛋白G親和層析法純化得到CD133抗體，在溫和的條件下與鼠抗人CD3單抗進行化學偶聯，制備抗CD133和抗CD3的雙特異性抗體；CCK8試劑盒檢測CIK和雙特異性抗體介導的CIK殺傷腫瘤細胞系。結果收獲腹水效價為1∶50 000，通過標準曲線計算出CD133單抗的濃度為3.2 mg/ml；成功構建了抗CD133/CD3雙功能特異性抗體介導的CIK；在相同的效靶比條件下，抗CD133/CD3介導的CIK對表達CD133的胰腺癌細胞系SW1990、胃癌細胞系SGC7901和卵巢癌細胞系A2780有更強的殺傷作用，與單純CIK相比有顯著差異，在效靶濃度為20∶1時，抗CD133/CD3雙特異性抗體介導CIK細胞較普通CIK對SW1990細胞株殺傷率提高了30.99%，對SGC7901細胞株殺傷率提高了24.42% (P＜0.05)。結論抗CD133/CD3雙功能抗體可以顯著改善CIK對CD133陽性腫瘤細胞的殺傷作用。

腫瘤干細胞；細胞因子誘導殺傷細胞；雙特異性抗體；CD133單抗；CD3單抗

腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中少量的具有自我更新功能并能產生異質性腫瘤細胞的一種干細胞[1]。越來越多研究表明，腫瘤干細胞在腫瘤發生發展過程和放化療耐受中起著重要作用[2]。跨膜糖蛋白CD133 (prominin-1)是在惡性腦瘤腫瘤干細胞中最早發現的表面標記分子，隨后發現其在腦瘤、白血病、黑色素瘤、腎癌、結直腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌等多種腫瘤中存在[3-8]。此外大量研究顯示，CD133與腫瘤大小、預后效果密切相關[9]。單克隆抗體具有激活免疫系統，抑制腫瘤細胞內的信號轉導通路，使毒素富集于腫瘤細胞周圍的作用[10]。由于單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高和低毒性等優勢[11]，在臨床治療效果突出，幾種抗體已被FDA批準用于治療腫瘤和血液病，如利妥昔單抗(抗CD20)、西妥昔單抗(抗表皮生長因子受體)、Pembrolizumab (PD-1)[12]。免疫療法被視為新型腫瘤治療方法，而雙特異性抗體同時結合了腫瘤特異性抗原和T淋巴細胞表面分子兩個不同的抗原，可以在靶細胞和效應細胞間架起橋梁，從而更有效地殺傷腫瘤細胞，被認為是有前途的治療惡性腫瘤手段[13]。基于以上發現，本研究將鼠抗人CD133和CD3單克隆抗體，在溫和的條件下進行化學偶聯，制備抗CD133和抗CD3的雙特異性抗體；成功構建了抗CD133/CD3雙功能特異性抗體介導的細胞因子誘導殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK)并在體外進行殺傷胰腺癌、胃癌和卵巢癌細胞系的實驗研究，為進一步探索CIK和抗體雙重協同性靶向殺傷腫瘤干細胞的增效機制奠定了基礎，為創建新型的靶向殺傷腫瘤干細胞的免疫治療策略提供科學依據。

材料和方法

1 細胞 鼠雜交瘤細胞HB12346、人胰腺癌細胞株SW1990、胃癌SGC7901和卵巢癌細胞系A2780均購于美國模式培養集存庫(American type culture collection，ATCC)，并于本實驗室保存。

2 主要試劑及儀器 無血清細胞培養基(DMEM；HyClone公司，新西蘭)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；HyClone公司，新西蘭)；鼠抗人CD3單克隆抗體(monoclonal antibody，TaKaRa公司，日本)；對照商品化鼠抗人CD133 (AC133)單克隆抗體購自美天旎公司(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)；鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標抗體及同型對照IgG1購自BD公司(San Diega，CA)；Traut’s試劑和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(SULFO-SMCC)試劑(賽默飛世爾科技公司，美國)；人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8，CCK8；DojinDo公司)；Protein G親和層析柱(BIO-RAD公司，瑞典)；流式細胞儀購自R＆D公司(San Diege公司，美國)。

3 鼠抗人CD133單克隆抗體制備 取8 ～ 10周齡雌性Balb/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0.5 ml/只，7 ～10 d后腹腔接種雜交瘤細胞HB12346每只小鼠1×106/0.2 ml，每天觀察小鼠狀態及腹水產生情況，約10 d后小鼠腹部明顯膨大，皮膚有緊張感即腹水形成。收集腹水，每只小鼠采4 ～ 6 ml腹水。將腹水高速離心，4℃ 10 000 r/min 10 min，收集上清，用ELISA方法測定抗體效價，分裝-80℃凍存備用。

4 鼠抗人CD133單克隆抗體純化 腹水4℃緩慢解凍，收集管內加入60 ～ 200μl pH 9.0，1 mol/L Tris-Hcl溶液，將注射器(去針頭部分)連接到超濾柱上，將10倍體積的結合緩沖液以1 ml/min的流速流過柱床，再加入待純化腹水樣品，控制流速直至樣品全部通過柱床后，再用5 ～ 10倍體積結合緩沖液洗柱。過柱純化過的CD133單克隆抗體用ELISA的方法測定效價。

5 CIK的培養 取健康志愿者外周靜脈血10 ml，肝素抗凝，用0.9%氯化鈉注射液1∶1稀釋后，加至淋巴細胞分離液上層，離心收集單個核細胞(PBMC)，用含6%自體血清的1640培養液調整細胞密度為2×106/ml，置于37℃，5% CO2培養箱中培養24 h后，加入鼠抗人CD3單克隆抗體50 ng/ ml，人重組白介素-2 1 000 U/ml，每2 d加液補充人重組白介素-2，在培養第14天，流式檢查細胞表型(CD3、CD4、CD8和CD56)后收獲CIK。

6 抗CD133/CD3雙特異性抗體介導CIK 我們按照文獻[14]方法制備雙特異性抗體。取鼠抗人CD3單克隆抗體(OKT3抗體)1 mg溶于5倍摩爾濃度的Traut’s試劑500μl，室溫下作用1 h，用Protein G親和層析柱過濾，移除未交聯的單克隆抗體；取鼠抗人CD133單克隆抗體(1 mg)溶于4倍摩爾濃度的交聯劑SULFO-SMCC 500μl，室溫下作用1 h，用Protein G親和層析柱過濾，移除未交聯的單克隆抗體；將已交聯的兩種單克隆抗體混合后4℃過夜，制備得到抗CD133/CD3雙功能特異性抗體。雙抗體蛋白產物通過8%非還原變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖、考馬斯亮藍染色檢測。離心收集培養14 d并經表型檢測的CIK細胞，PBS洗滌兩次，按1×106CIK/50 ng雙抗濃度加入抗CD133/CD3雙功能特異性抗體，混勻后室溫靜置60 min，PBS洗滌沒有結合上的抗體，CIK重懸培養液中，按一定比例加入靶細胞培養液中，得到抗CD133/CD3雙功能特異性抗體介導的CIK(Anti CD133/CD3 bispecific antibodies CIK，簡稱BsAb-CIK)。

7 細胞毒作用檢測 以成熟CIK為效應細胞，以人胰腺癌細胞株SW1990、胃癌SGC7901和卵巢癌細胞系A2780作為靶細胞，檢測對比BsAb-CIK細胞的殺傷作用。取對數生長期腫瘤細胞，10 000/孔鋪96孔細胞培養板，第2天分別加入CIK或BsAb-CIK(50 ng/L×106的CIK)，以效靶比1∶1、5∶1、10∶1和20∶1的濃度(每個濃度3個平行孔)共同培養4 ～ 6 h，實驗同時設單純CIK對照組，靶細胞對照組和空白組。棄上清液，PBS漂洗細胞兩次后，加入Cell counting Kit CCK8細胞計數試劑盒中應用液繼續培養4 h，96孔細胞培養板放入酶聯儀檢測在450 nm處吸光度OD值，細胞殺傷率計算公式：

殺傷率(%)=[(1-實驗組OD值)/(CIK對照OD值+靶細胞對照OD值)]×100%。

8 統計學分析 采用SPSS11.5統計學軟件進行統計分析。計量資料以表示，采用t檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 鼠雜交瘤細胞HB12346的培養 為制備CD133單克隆抗體，選擇可分泌CD133抗體的雜交瘤細胞株HB12346培養，顯微鏡下觀察到細胞透光性好，細胞增殖快。細胞形態見圖1。

圖 1 倒置顯微鏡下(40倍)觀察雜交瘤細胞HB12346 形態Fig. 1 Morphology of hybridoma cells (HB12346) in microscope (40×)

2 自制CD133單克隆抗體效價的測定 ELISA法測定自制CD133單克隆抗體的效價為1∶50 000，比較標準曲線計算出CD133單抗的濃度為3.2 mg/ ml。通過8%非還原變性SDS-PAGE蛋白電泳檢測CD133單克隆抗體，CD133單抗大小為150 kU，見圖2。

3 構建抗CD133和抗CD3的雙特異性功能抗體通過8%非還原變性SDS-PAGE蛋白電泳檢測證實單體蛋白大小為150 kU，交聯后的雙特異性抗體的二聚體蛋白為300 kU。見圖3。

4 流式檢測體外殺傷實驗中腫瘤細胞株的CD133表達 通過流式細胞儀對3種不同腫瘤細胞株的CD133表面抗原進行檢測。其中SGC7901的陽性率為59.06%，SW1990表達CD133為99.86%，A2780為18.4%(圖4)。選取這3種CD133不同表達水平的腫瘤細胞作為比較單純CIK和BsAb-CIK細胞毒殺傷作用的靶細胞。

圖 2 8%非還原變性SDS-PAGE蛋白電泳檢測CD3單抗和純化后CD133單克隆抗體Fig. 2 Coomassie blue staining of mouse anti-human CD3 and mouse anti-human CD133 monoclonal antibody in 8% nonreducing SDS-PAGE

圖 3 8%非還原變性SDS-PAGE蛋白電泳檢測CD133/CD3兩種抗體偶聯的二聚體蛋白Fig. 3 Coomassie blue staining of anti-CD133/anti-CD3 BsAb in 8% non-reducing SDS-PAGE

5 雙特異性抗體介導CIK體外殺傷腫瘤細胞的毒性 用CCK8試劑盒檢測靶細胞的OD值，按照公式統計細胞殺傷率。結果發現，在SW1990細胞中CIK組在1∶1、5∶1、10∶1和20∶1效靶濃度殺傷率分別是11.07%、19.43%、29.82%和47.79%；BsAb-CIK組在對應效靶濃度殺傷率分別為13.01%、30.23%、55.03%和78.78%。在SGC7901細胞中CIK組在1∶1、5∶1、10∶1和20∶1效靶濃度殺傷率分別是10.37%、18.99%、30.85%和41.92%；BsAb-CIK組在對應效靶濃度殺傷率分別為11.02%、23.43%、41.22%和66.34%。在A2780細胞中CIK組在1∶1、5∶1、10∶1和20∶1效靶濃度殺傷率分別是9.39%、17.61%、29.07%和40.54%；BsAb-CIK組在對應效靶濃度殺傷率分別為9.77%、26.07%、36.02%和51.61%。經統計學分析表明，經過抗CD133/CD3雙特異性抗體裝載的CIK細胞對表達CD133的胰腺癌細胞株SW1990和胃癌細胞株SGC7901的殺傷作用明顯大于單純CIK組(P＜0.05)，而對相對低表達CD133的卵巢癌細胞株A2780的殺傷作用較高表達的兩組殺傷毒性略低，但較單純CIK組細胞毒性有所增強(P＜0.05)。見圖5。

圖 4 FACS檢測結3種腫瘤細胞系CD133表達Fig. 4 Expression of CD133 in three types of cancer cell lines. (a) SGC7901 (b) SW1990 and (c) A2780

圖 5 CIK和雙特異性抗體裝載CIK殺傷不同程度表達CD133結腫瘤細胞系Fig. 5 Killing effects of CIK and BsAb-CIK on cancer cell lines with different expression of CD133 (n=3.)(E: T Ratio: effector-to-target ratio)

討 論

目前的腫瘤免疫治療策略有疫苗、T細胞過繼免疫治療、針對腫瘤細胞的單克隆抗體或免疫調節分子(免疫檢查點)[15]。腫瘤干細胞已被證明在腫瘤發生和進展中起著重要支持作用，并且與腫瘤抵抗放、化療直接相關[9]。因此靶向腫瘤干細胞的免疫治療成為根治腫瘤的新策略，而 CD133作為腫瘤干細胞的表面標記分子也成為腫瘤治療的理想靶點[16-17]。由于直接作用于腫瘤干細胞的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)還沒有問世[8,18]，而單純CIK不能靶向殺傷腫瘤干細胞，鑒于單抗藥物靶向治療腫瘤在臨床上取得的成就與應用單抗CD44靶向消除人粒細胞性白血病干細胞的研究取得的重要進展[19]，和CIK作為臨床過繼免疫治療新一代細胞所兼具的T淋巴細胞強大的殺瘤活性與NK 細胞非MHC 限制性殺瘤特征,我們利用化學交聯試劑將抗CD133和CD3抗體偶聯成雙特異性抗體，成功構建了BsAb-CIK新型效應細胞，并在體外對不同程度表達CD133抗原的腫瘤細胞系進行殺傷以鑒定其細胞毒性。我們的體外殺傷試驗研究結果表明，BsAb-CIK在同一個效靶比濃度下，對較高表達CD133抗原的靶細胞SW1990細胞、SGC7901細胞殺瘤效果要明顯強于單純CIK組(P＜0.01)。 而BsAb-CIK在殺傷相對低表達CD133抗原的靶細胞A2780細胞時，較殺傷其他兩種高表達CD133抗原的腫瘤細胞的細胞毒性有所降低，提示腫瘤細胞被殺傷的程度與細胞表面的CD133表達水平高低相關。以上實驗結果表明，抗CD133/CD3雙特異性抗體修飾后的CIK不僅直接發揮廣譜殺傷腫瘤細胞的細胞毒性，而且增加了靶向殺傷CD133陽性腫瘤干細胞的強大作用。

綜上所述，本研究結果為創建高效靶向殺傷CD133陽性腫瘤干細胞的新型免疫治療策略與方案提供了重要科學論據，為未來應用于臨床的惡性腫瘤免疫治療指引新的發展方向。

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Effects of cytokine-induced killer cells on CD133 positive cancer cells mediated by anti-CD3/ anti-CD133 bispecific antibodies

LYU Haiyan, LIU Chuanjie, HUANG Jianhua, HAN Weidong
Department of Immunology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

HAN Weidong． Email: hanwdrsw@sina．com

ObjectiveTo compare the killing effect of anti-CD3/anti-CD133 bispecific antibodies - cytokine-induced killer (BsAb-CIK) with general CIK cells on CD133 positive tumor cells．MethodsHybridoma technique was used to generate human anti-CD133 monoclonal antibody, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was utilized to detect the titer of antibody． Anti-CD3/anti-CD133 bispecific antibodies were produced through chemical coupling with anti-CD3 and anti-CD133 antibody, which was purified by protein G． The killing effects of BsAb-CIK and general CIK on CD133 positive cancer cells were evaluated by CCK-8．ResultsThe titer of anti-CD133 antibody in ascites was 1∶50 000 and the concentration was 3．2 mg/ml． The CIKs bounded by bispecific antibody were established successfully． The experiment results showed that mBsAb-CIK had better activity than general CIK in mediating lysis of CD133 positive cells, such as SW1990, 7901 and A2780 cells, in the same condition of effector-to-target ratio． In effector-to-target ratio of 20∶1, the killing effects was enhanced about 30．99% to SW1990 by BsAb-CIK comparing to general CIK, and it also enhanced about 24．42% to SGC7901 with significant differences (P＜0．05)．ConclusionThe killing effects of CIK to CD133 positive tumor cells can be enhanced significantly by anti-CD3/anti-CD133 bispecific antibodies．

neoplastic stem cells; cytokine induced killer cells; bispecific antibody; CD133; CD3

R 730.2

A

2095-5227(2015)12-1227-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.018

時間：2015-11-06 10:33:59

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151106.1033.002.html

2015-09-28

呂海燕，女，學士，主管技師。研究方向：腫瘤免疫學。Email:haiyan81109@126.com

韓為東，男，博士，主任，教授。Email: hanwdrsw@sina. com