應用單細胞cDNA擴增技術鑒定循環腫瘤細胞

王玲兄，潘 飛，李晶晶，卜芳芳

解放軍總醫院 腫瘤中心實驗室，北京 100853

應用單細胞cDNA擴增技術鑒定循環腫瘤細胞

王玲兄，潘 飛，李晶晶，卜芳芳

解放軍總醫院 腫瘤中心實驗室，北京 100853

目的建立單細胞cDNA擴增技術，實現在分子水平鑒定循環腫瘤細胞。方法建立結腸癌循環腫瘤細胞模型，通過免疫熒光染色和顯微切割技術分離出單個血細胞和腫瘤細胞；裂解細胞后利用堿基修飾的P1(dT)24引物反轉錄出cDNA第一鏈，并給第一鏈cDNA加上PolyA尾后利用堿基修飾的P2(dT)24引物合成第二鏈cDNA，然后利用P1(dT)24和P2(dT)24引物擴增分別得到血細胞和腫瘤細胞的全長cDNA；最后通過PCR檢測細胞特異的標記物CD45、EpCAM和CK19。結果改良后的單細胞cDNA擴增方法能夠獲得高質量的全長cDNA，并能顯著增加PCR檢測效率；利用擴增得到的cDNA通過PCR檢測細胞表面標記物CD45、EpCAM和CK19的表達，能有效鑒定出外周血中混雜的腫瘤細胞。結論通過單細胞cDNA擴增技術在基因水平識別腫瘤細胞，建立了一種新的循環腫瘤細胞的鑒定方法。

單細胞cDNA擴增技術；循環腫瘤細胞；激光捕獲顯微切割；聚合酶鏈式反應

解析單細胞的行為對于深入認識腫瘤、神經系統疾病等尤為重要。由于單細胞RNA量少且穩定性差，相對于基因組DNA水平單細胞轉錄組RNA水平的檢測技術尚不成熟。Brady和Iscove[1]最早建立了基于PCR技術對單個細胞cDNA指數擴增的方法，隨后Eberwine等[2]建立了基于T7 RNA連接酶體外轉錄的cDNA的線性擴增的方法，成為單細胞轉錄組RNA檢測的初步探索。2006年，Kurimoto等[3]改進了單細胞cDNA擴增方法，將定向的PCR擴增與線性擴增相結合，在此基礎上研究者們不斷對該技術進行改進，以求在高覆蓋率和高準確性的前提下，使基因表達的代表性和再現性都有了明顯的提高[4-6]。近來循環腫瘤細胞成為腫瘤研究的熱點，腫瘤細胞經過血液循環播散至遠隔器官是惡性腫瘤患者最主要的死亡原因[7]。循環腫瘤細胞的數量及表型的改變是研究惡性腫瘤生物學特征及腫瘤進展的窗口[8]；更重要的是循環腫瘤細胞是腫瘤細胞異質性的典型表現，通過研究循環腫瘤細胞的生物學行為、遺傳及表觀遺傳學改變對揭示腫瘤的轉移及耐藥機制非常重要[9-11]。由于循環腫瘤細胞量少、不易捕獲，單細胞技術已廣泛應用于循環腫瘤細胞的研究中[12-14]。本文中，我們以結腸癌循環腫瘤細胞為模型，通過顯微切割技術捕獲單個腫瘤細胞；并且成功建立單細胞cDNA擴增的技術，獲得了高質量的循環腫瘤細胞的全長cDNA，最后利用PCR技術檢測腫瘤細胞標記物，實現了在基因水平鑒定循環腫瘤細胞。

材料和方法

1 材料 固定透膜液(美國BD Cytofix/Cytoperm公司)，顯微切割PEN膜(德國Lecia公司)，10×PCR bufferⅡ和MgCl2(美國Applied Biosystems公司)，DTT、SuperScriptⅢ、dATP mix、RNase H、rTdT和細胞核復染劑DAPI(美國Invitrogen公司)，Rnase inhibitor和PCR產物純化試劑盒(德國Qiagen公司)，Ribonuclease inhibitor、dNTP mix、10×ExonucleaseⅠ、10×ExTaq buffer和ExTaq Hot Start Version(大連Takara公司)，DDW(美國Ambion公司)，T4 gene 32 protein(瑞士Roche公司)，抗EpCAM抗體、抗CD45單克隆抗體(美國BD公司)。

2 細胞培養 結腸癌腫瘤細胞系HCT116細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每2 ～ 3 d傳代1次，將培養的腫瘤細胞經胰酶消化后，取部分懸液備用。3 外周血循環腫瘤細胞模型建立 用ACD枸櫞酸采血管采取正常獻血者肘正中靜脈清晨空腹外周靜脈血2 ml。室溫300×g離心10 min，棄血清，加入紅細胞裂解液，室溫避光孵育15 min后，200×g離心5 min，小心吸棄上清，重復裂解1次，去除外周血中的紅細胞，計數剩余白細胞的數量，后按每107個白細胞加入1 000個腫瘤細胞的比例，向所得白細胞懸液中加入結腸癌細胞HCT116。所得混合細胞懸液室溫300×g離心5 min，吸棄上清后加入200μl固定透膜液，4℃避光30 min，離心棄上清，緩沖液洗滌兩次，10% BSA封閉15 min后，用PE/Cy5-anti-CD45和FITC-anti-EpCAM避光染色20 min，再用細胞核復染劑DAPI染核。將細胞稀釋至濃度約為105/ml，滴加至顯微切割專用的PEN膜50 mm平皿內備用[12]。

4 激光捕獲顯微切割獲得單細胞 將細胞懸液均勻涂布于PEN膜上，置于顯微切割儀(LMD6000，Lecia)的卡槽內，在其下方放置RNase-free 200μl PCR管用于收集切割下的細胞。PCR管蓋正對玻片，管蓋內加入4.5μl細胞裂解液(表1)。收集到的細胞如圖1所示，扣緊管蓋后最高轉速離心，使細胞片落入細胞裂解液中，冰上保存。每個PCR管收集1個單細胞，全部細胞切割分離要在2 h內完成[15]。

5 單細胞全長cDNA擴增 首先，將上一步所得含單細胞的PCR管置于70℃金屬浴90 s后冰浴1 min，充分裂解細胞，同時裂解液中的cDNA第一鏈引物P(dT)24與模板RNA變性并退火結合(圖1)。然后加入0.3μl反轉錄預混液(表2)，反轉錄合成cDNA第一鏈；反應條件：50℃，5 min；70℃，10 min；冰浴1 min以上。加入1μl外切酶預混液(表3)，去除體系中游離的cDNA第一鏈引物；反應條件：37℃，30 min；80℃，25 min；冰浴1 min以上。加入6μl末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)預混液(表4)，在第一鏈cDNA 3’端加Poly A尾并去除體系中的RNA；反應條件：37℃，15 min；70℃，10 min；冰浴1min以上。將上一步所得樣品分裝到4個PCR管，每管3μl，加入19μl PCR預混液Ⅰ(表5)合成cDNA第二鏈；反應條件：95℃變性，3 min；50℃退火，2 min；72℃延伸，3 min；冰浴1 min以上；合成雙鏈cDNA，模式圖見圖1。每管內加入19μl PCR混合物Ⅱ(表6)，并加入1滴礦物油，擴增雙鏈cDNA；反應條件：95℃變性，30 s；67℃退火，1 min；72℃延伸，3 min，延伸時間每個循環增加6 s；共24個循環。最后，將所得PCR產物(4個PCR管，共計164μl)混合，用PCR產物純化試劑盒提純產物，用50μl EB緩沖液進行洗脫。所得cDNA擴增產物于-80℃冰箱保存1年以上。第一鏈cDNA引物P1(dT)24序列：AT ATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTT；第二鏈cDNA引物P2(dT)24序列：ATA TCTCGAGGGCGCGCCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTT。

6 細胞表面標記物的PCR擴增 對白細胞特異性標記物CD45和上皮型腫瘤細胞表面標記物EpCAM和CK19/CK19進行PCR檢測。分別以0.4μl單細胞裂解液或單細胞cDNA擴增產物為模板，進行30個循環的擴增。擴增產物通過2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測。β-actin引物序列，F：5'CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3'，R：5'GCTGTCAC CTTCACCGTTCC3'；EpCAM引物序列，F：5'AATCG TCAATGCCAGTGTACTT3'，R：5'TCTCATCGCAGT CAGGATCATAA3'；CK19，F：5'ACCAAGTTTGAG ACGGAACAG3'，R：5'CCCTCAGCGTACTGATTTC CT3'；CD45引物序列，F：5'ACAGCCAGCACCTTT CCTAC3'，R：5'GTGCAGGTAAGGCAGCAGA3'。

圖 1 單細胞雙鏈cDNA模式圖Fig. 1 Schematic representation of double-stranded cDNA

表1 單細胞裂解液配方Tab. 1 Lysate formula of single cell

表2 反轉錄預混液配方Tab. 2 Mixture of reverse transcription system

表3 外切酶預混液配方Tab. 3 Mixture of ExoⅠ

表4 末端脫氧核苷酸轉移酶預混液配方Tab. 4 Mixture of TdT

表5 PCR預混液Ⅰ配方Tab. 5 MixtureⅠof PCR

表6 PCR預混液Ⅱ配方Tab. 6 MixtureⅡof PCR

結 果

1 顯微切割獲得單細胞 免疫熒光染色鑒別出腫瘤細胞和白細胞，分別進行切割；其中綠色熒光標記而紅色熒光缺失的細胞為腫瘤細胞，紅色熒光標記而綠色熒光缺失的細胞為白細胞。見圖2。

2 cDNA擴增成功 如圖3A所示，將1 ～ 12號單細胞的cDNA擴增產物進行2%濃度瓊脂糖凝膠電泳，其中10號和12號的擴增產物聚集在100 ～300 bp，認為是存在RNA的降解或引物二聚體的污染；其余cDNA擴增產物彌散范圍在300 ～ 2 000 bp，均為合格擴增產物，且不含基因組DNA污染。

3 cDNA擴增增加PCR敏感性 分別以擴增前和擴增后的單細胞cDNA為模板，對β-actin基因進行PCR擴增，所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，以擴增后的cDNA為模板均能高效擴增出β-actin基因；但用未經過擴增的cDNA為模板進行擴增β-actin基因時，僅6號樣本擴增效率高，其余樣本擴增效率低或擴增失敗；結果證實，經過cDNA擴增能夠顯著增加PCR的敏感性。見圖3B。

4 細胞特異性基因擴增鑒定循環腫瘤細胞 按照免疫熒光染色的結果將樣本分為白細胞組和腫瘤細胞組，選擇了白細胞特異性標記基因CD45和上皮細胞表面標記基因EpCAM和CK19進行PCR檢測，結果顯示，白細胞組CD45均擴增成功，而EpCAM擴增失敗(圖4A)；相反，腫瘤細胞組CD45擴增失敗，而EpCAM和CK19擴增成功(圖4B)，結果證實通過細胞特異性基因擴增能夠鑒定出外周血中的腫瘤細胞。

討 論

本文旨在建立一種單細胞cDNA擴增技術，實現在單細胞表達譜水平鑒定和研究循環腫瘤細胞。循環腫瘤細胞的捕獲技術有了突飛猛進的發展，然而關于循環腫瘤細胞的鑒定和后續研究技術尚不成熟[16-17]。

我們首先建立了結腸癌的外周血循環腫瘤細胞模型，結腸癌細胞HCT116是上皮來源的腫瘤細胞，同時表達上皮細胞的表面標記物EpCAM和CK19[18]，而血源性細胞的表面標記物CD45表達為陰性，所以利用HCT116細胞建立外周血循環腫瘤細胞模型有利于進行后期研究。我們通過免疫熒光染色找到疑似腫瘤細胞和疑似白細胞，對這些細胞進行顯微切割成單個細胞，然后對細胞進行裂解，以含RNA的裂解液為模板，通過用修飾的Oligo dT法進行單細胞cDNA擴增，得到高質量的全長cDNA；我們的擴增方法是在2007年Kurimoto等[4]的技術上改進的，一方面，我們利用裂解液為模板進行擴增，較先提取RNA后擴增的方法能夠顯著增加cDNA的得率；另一方面，我們選擇兩段非人類基因組序列的24個堿基序列修飾Oligo dT作為擴增引物，將細胞內含有PolyA尾的全部mRNA反轉成兩端具有特異序列的雙鏈cDNA。再以兩段修飾的Oligo dT作為引物，進行PCR以達到擴增cDNA的目的。這種通過對特異性序列引入的方法，大大提高了擴增的效率，也避免了擴增循環中引入過長Oligo dT的困擾。但是這種技術也存在一定缺陷，其僅能擴增mRNA 3'端的300 ～ 2 000 bp的序列。

圖 2 顯微切割前熒光染色鑒定細胞種類。 EpCAM陽性CD45陰性細胞為腫瘤細胞；EpCAM陰性CD45陽性細胞為白細胞Fig. 2 Cells were idetified by immunofluorescence staining and isolated by laser capture microdissection. Cells with positive EpCAM and negative CD45 showed as tumor cells, and cells with negative EpCAM and positive CD45 showed as white cells

圖 3 A：單細胞cDNA擴增產物電泳 B：單細胞cDNA 為模板PCR擴增β-actin產物電泳Fig. 3 A: Electrophoresis of amplified products by single-cell cDNA; B: Electrophoresis of β-actin amplified by PCR with singlecell cDNA as sample

圖 4 以擴增后的單細胞cDNA為模板PCR擴增CD45、EpCAM和CK19，白細胞為CD45+EpCAM-細胞(4A)，腫瘤細胞為CD45-EpCAM+CK19+細胞(4B)Fig. 4 CD45, EpCAM and CK19 amplified by gene specific PCR with amplified single-cell cDNA as sample, the white cells were shown as CD45+EpCAM-(4A), and tumor cells were shown as CD45-EpCAM+CK19+(4B)

目前，單細胞cDNA擴增技術多被應用于單細胞表達譜芯片技術，而對于沒有條件進行芯片研究的實驗室，通過將單個腫瘤細胞極少量cDNA擴增，使其達到普通PCR可檢測的濃度，進行特異基因的常規檢測，可對腫瘤細胞的性質、來源、分化等進一步確認，還可對其EMT相關基因表達水平進行檢測，實現更為準確地研究和評估腫瘤預后的目的。也可用于送檢芯片前的預檢測或對芯片結果的再驗證，以節約實驗成本，使單細胞PCR檢測靈敏度大大提高。為今后研究單個腫瘤細胞提供了更敏感的檢測方法。

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Identification of circulating tumor cells by single-cell cDNA amplification techniques

WANG Lingxiong, PAN Fei, LI Jingjing, BU Fangfang
Cancer Center Lab, Division of Internal Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

BU Fangfang, Email: bflily@163．com

ObjectiveTo identify circulating tumor cells by single-cell cDNA amplification techniques．MethodsIndividual tumor cells from blood cells were separated by immunofluorescence staining, and then the cells were lysed and total RNA was protected by the lysate． First strand cDNA was transcripted using modified primer P1(dT)24and then tailed with poly dA． Second-strand cDNA was synthesized using modified primer P2(dT)24． Then the double-strand cDNA was amplificated using primer P1(dT)24and P2(dT)24．At last, the amplificated cDNA was used to detect cell specific marker of CD45, EpCAM and CK19 by PCR．ResultsOur results showed that the high-quality full-length cDNA was produced by the single-cell cDNA amplification techniques which could improve the effect of PCR significantly． The expression of CD45, EpCAM and CK19 detected by cDNA amplification techniques combined with gene specific PCR could identify tumor cells from blood cells effectively．ConclusionSingle-cell cDNA amplification techniques can identify tumor cells from blood cells．

single-cell cDNA amplification techniques; circulating tumor cells; laser capture microdissection; polymerase chain reaction

R 730.43

A

2095-5227(2015)12-1222-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.017

時間：2015-09-24 17:13:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150924.1713.008.html

2015-06-17

國家自然科學基金項目(81301781)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81301781)

王玲兄，女，本科，技師。研究方向：腫瘤分子靶向治療的驅動基因研究。Email: lingxiongw@163.com

卜芳芳，女， 博士，助理研究員。Email: bflily@163.com