波生坦對糖尿病小鼠心肌組織纖維相關生長因子的影響

趙 華，李傳威，張 健，楊 波

解放軍總醫院 心血管內科，北京 100853

波生坦對糖尿病小鼠心肌組織纖維相關生長因子的影響

趙 華，李傳威，張 健，楊 波

解放軍總醫院 心血管內科，北京 100853

目的探討波生坦對糖尿病小鼠心肌組織纖維相關生長因子的影響。方法將6周齡雄性C57BL/6小鼠分為3組：對照組、糖尿病組、糖尿病+波生坦組，每組15只。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)按70 mg/kg單次劑量腹腔注射。在STZ注射后即刻、1周、2周測定小鼠的空腹血糖，以確定糖尿病模型是否建立。在STZ注射后第2天糖尿病+波生坦組小鼠灌胃波生坦(100 mg/kg)，其余兩組灌胃等量的0.9%氯化鈉注射液直到16周。應用反轉錄酶-聚合酶連鎖反應檢測轉化生長因子(transforming growth factor beta，TGF-β)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及膠原蛋白1(Collagen-1)的mRNA的表達。結果16周后，測量小鼠空腹血糖，糖尿病組與糖尿病+波生坦組接近(P＞0.05)，兩組血糖與對照組相比顯著增高(P＜0.01)。糖尿病+波生坦組心臟VEGF的mRNA水平較糖尿病組增高(P＜0.05)，糖尿病+波生坦組與糖尿病組相比，心肌纖維相關因子TGF-β、CTGF及Collagen-1的mRNA水平較低(P＜0.05)。結論內皮素受體拮抗劑波生坦能降低心肌纖維相關生長因子的表達。

波生坦；糖尿病；纖維相關生長因子；C57BL/6小鼠

長時間處于糖尿病狀態會導致小血管及微血管結構和功能發生改變，同時也會引起許多糖尿病相關并發癥，例如腦血管疾病、糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、糖尿病周圍血管病變、動脈粥樣硬化等。糖尿病是心血管疾病的獨立危險因素[1]，能夠引起細胞外基質產生，細胞外基質的改變已被證實為心肌病結構性改變的標志。細胞外基質的形態學及生物化學性質的紊亂與心功能降低直接相關[2]。細胞外基質由膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白、水和蛋白多糖及整合素等組成，這一結構不僅支持細胞的生存，而且起到調節細胞間及細胞與血管組織的細胞外基質的交互作用[3]。1型和3型膠原蛋白都出現在正常和異常的心肌組織中，但是1型膠原蛋白(Collagen-1)占有主導地位。1型膠原蛋白對增加左心室重量和彌散心肌纖維化起到重要作用，甚至在中度高血糖的糖尿病中會出現心肌細胞肥大和心肌間質纖維化[4]。生長因子如轉化生長因子(transforming growth factor beta，TGF-β)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、胰島素樣生長因子1，纖維母細胞生長因子、表皮生長因子在糖尿病并發癥中起重要作用。TGF-β與CTGF參與細胞外基質的積聚，VEGF在血管的形成過程中起著重要的作用，同時也促進損傷組織的修復[5]。內皮素-1是一種強效收縮肽，起到促進纖維化的作用。高血糖可促進內皮素-1受體上調，在心肌細胞肥大中，內皮素-1與細胞外基質積聚有關[6]。本實驗主要探究VEGF、TGF-β、CTGF和Collagen-1在糖尿病小鼠中的改變及波生坦對于糖尿病心肌纖維相關生長因子的潛在保護效應。

材料和方法

1 實驗動物 本實驗符合實驗動物研究指南[7]，實驗程序遵循解放軍總醫院動物實驗中心管理指南，并通過倫理委員會審查。雄性C57BL/6小鼠45只飼養在解放軍總醫院動物實驗中心屏障實驗室，環境溫度：24℃，相對濕度：50% ～ 60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪聲＜50 db，所有的小鼠都給予相同的食物和水。

2 小鼠糖尿病模型建立 在一整夜的禁食后，糖尿病組和糖尿病+波生坦組注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)。STZ溶解在檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=4.2)中，按70 mg/kg單次劑量腹腔注射，對照組注射等量的檸檬酸緩沖溶液。使用血糖儀在STZ注射后即刻及1周、2周、16周測定小鼠的空腹尾靜脈血糖，并比較各組血糖之間的差異，空腹血糖＞16.8 mmol/L即糖尿病模型建立成功。

3 分組處理 C57BL/6雄性小鼠在6周齡時隨機分為3組，對照組(n=15)、糖尿病組(n=15)、糖尿病+波生坦組(n=15)。在STZ注射后第2天第3組小鼠灌胃波生坦(100 mg/kg)，其余兩組灌胃等量的0.9%氯化鈉注射液(每天灌胃1次)，直到第16周處死所有小鼠，取出心肌組織，并用Real time PCR檢測心肌纖維相關因子的表達。

4 Real time PCR分析小鼠心肌組織中的TGF-β、CTGF、VEGF和Collagen-1的mRNA表達 用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提供的操作步驟提取3組小鼠心肌組織中總RNA。取5μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。用UltraSYBR Mixture(With ROX)(CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0956)進行擴增，實驗操作按產品說明書進行。擴增程序：95℃10 min，(95℃15 s，60℃60 s)×45個循環。Real Time反應體系：2×UltraSYBR Mixture：10μl，上游引物(10μmol/ L)：0.4μl，下游引物(10μmol/L)：0.4μl，模板：2μl，加入滅菌蒸餾水至20μl。以正常心肌組織為校正樣本，反應體系以甘油醛232磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照，VEGF引物序列：上游引物5'-TGTGCAGGCTGCTGTAACGATGA-3'，下游引物5'-GTGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGAT-3'；TGF-β引物序列：上游引物5'-CTCCCGTGGCTTCTAGT GC-3'，下游引物5'-GCCTTAGTTTGGACAGGATC TG-3'；CTGF引物序列：上游引物5'-GCCTGTTC TAAGACCTGTGGGATGG-3'，下游引物5'-TAGCC CTGTATGTCTTCACACTGGT-3'；Collagen-1引物序列：上游引物5'-GAACATCCGCAGCCCCGAA-3'，下游引物5'-CGATCCAGTACTCTCCGCTCT-3'；GAPDH引物序列：上游引物5'-ACCACAGTCCA TGCCATCAC-3'，下游引物5’-TCCACCACCCTGT TGCTGTA-3'。

5 統計學方法 所有數據使用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。定量數據用表示，TGF-β、CTGF、VEGF和Collagen-1的mRNA表達水平用方差分析，兩組間有差異的采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 空腹血糖的比較 檢測3組小鼠注射STZ后即刻、1周、2周及16周的尾靜脈血糖值，注射后即刻各組空腹血糖水平差異無統計學意義(P＞0.05)。在1周、2周及16周時糖尿病組及糖尿病+波生坦組與對照組相比空腹血糖水平差異有統計學意義(P＜0.05)，糖尿病組與糖尿病+波生坦組相比空腹血糖水平差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組小鼠血糖的比較Tab. 1 Comparison of FBG in mice of three groups (mmol/L)

表2 Real-time PCR 檢測小鼠心肌組織mRNA表達Tab. 2 Comparison of mRNA of myocardial tissue in mice expression by real-time PCR

2 Semiquantitative RT-PCR檢測各組小鼠心肌組織中TGF-β、CTGF、VEGF和Collagen-1的mRNA表達 與對照組比較，糖尿病組VEGF的mRNA表達下降，TGF-β、CTGF和Collagen-1的mRNA表達均升高。與對照組比較，糖尿病組與糖尿病+波生坦組VEGF表達下降(P＜0.05)(圖1)。與對照組比較，糖尿病組與糖尿病+波生坦組TGF-β、CTGF和Collagen-1表達升高(P＜0.05)。與糖尿病組相比，TGF-β、CTGF和Collagen-1在糖尿病+波生坦組表達下降(P＜0.05)。見表2。

圖 1 半定量實時聚合酶鏈反應對小鼠心肌組織的分析Fig. 1 Semiquantitative real-time PCR analysis of myocardial tissue in mice

討 論

本研究發現，內皮素受體拮抗劑波生坦在糖尿病小鼠中能夠調節纖維相關生長因子的異常表達。有研究發現，糖尿病心肌纖維化部分原因是由于激活了內皮系統，導致心肌和血管功能和結構的異常[8]。內皮素受體拮抗劑波生坦對糖尿病心血管并發癥具有潛在的保護作用[9]。

本研究表明，糖尿病小鼠心臟的VEGF表達下降，纖維相關因子的表達(TGF-β、CTGF和Collagen-1)升高。先前的研究表明，在STZ誘導的動物模型中，心肌的VEGF的mRNA表達水平有極大程度的下降。在糖尿病患者尸體檢測心臟的VEGF，與非糖尿病患者相比雙倍下降[10]。本研究觀察到，VEGF在所有糖尿病小鼠中的表達都是下降的，用波生坦治療過的糖尿病小鼠的VEGF表達升高。然而，糖尿病中內皮系統與VEGF相關的確切機制還不是很清楚。現已經證實，無論是在糖尿病的早期還是晚期階段，細胞外基質聚集與TGF-β和CTGF相關[11]。幾種實驗和臨床證據都表明，TGF-β在糖尿病的心肌間質的纖維化過程中起著重要的作用[12-13]。在心肌纖維化過程中另一個重要的纖維生長因子是CTGF，無論是1型還是2型糖尿病動物模型中，CTGF的mRNA在心肌的表達都是升高的[14]。在糖尿病中，Collagen-1促進心肌的細胞外基質產生與聚集[15]。本研究表明，內皮素受體拮抗劑波生坦能夠降低TGF-β、CTGF和Collagen-1的異常表達，同時能夠保留VEGF的表達功能，因此波生坦可能在減輕心肌纖維化中起著一定的作用。

糖尿病對內皮系統的激活起著重要的作用，無論是在糖尿病的動物模型還是在糖尿病病人中[16-17]，血漿中內皮素水平都是升高的。另外已有報道，內皮素受體拮抗劑在糖尿病的實驗中能夠減少細胞外基質蛋白產生[18]。因此，治療、干預、抑制內皮系統在減輕糖尿病相關的心血管并發癥中可能起著重要的作用。本研究表明，內皮素受體拮抗劑波生坦可在糖尿病小鼠中減輕纖維相關因子的表達，并改善VEGF的表達水平。本研究存在一定的限制，我們沒有檢測治療前后血漿中內皮素的水平及應用病理學去檢測心肌的纖維程度，本研究主要用來設計檢測波生坦是否能夠減輕心肌組織纖維相關因子的異常表達。更進一步的檢測心臟功能及心肌組織病理改變將會在后續研究中進行。

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Effect of Bosentan on expression of fibrotic related growth factors of myocardial tissue in diabetic mice

ZHAO Hua, LI Chuanwei, ZHANG Jian, YANG Bo
Department of Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

YANG Bo． Email: dryangb@aliyun．com

ObjectiveTo explore the effect of Bosentan on the expression of fibrotic related growth factors of myocardial tissue in diabetic mice．MethodsMale 6-week old C57BL/6 mice were divided into 3 groups: control group, diabetes mellitus (DM) group and DM-B group (diabetes with bosentan group), 15 in each group． Streptozotocin (STZ) was injected intraperitoneally accounting for 70 mg/kg for single dose which was used to confirm that diabetes was induced in the mice, fasting blood glucose (FBG) was measured at 0-, 1-, 2-week after STZ injection． The second day after STZ injection, mice in DM-B group underwent intragastric administration of Bosentan (100 mg/kg), mice in the rest of the two groups were injected with the same amount of saline lavage for 16 weeks． RT-PCR was applied to detect transforming growth factor beta (TGF-β), connective tissue growth factor (CTGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and the expression of RNA (mRNA) which was the messenger of collagen protein 1 (collagen - 1)．ResultsAfter 16 weeks, fasting blood glucose in mice of DM group and DM-B group was measured which was similar without significant differences (P＞0．05), but it was significantly higher in these two groups when compared with control group (P＜0．01)． Compared with DM group, the cardiac VEGF mRNA level in DM-B group was significantly higher (P＜0．05), and the expression of fibrotic related growth factors TGF-β, CTGF and collagen-1 was significantly lower (P＜0．05)． Conclusion These findings suggest that endothelin receptor antagonists Bosentan can reduce the expression of fibrotic related growth factors of myocardial tissue in diabetic mice．

Bosentan; diabetes mellitus; fibrotic related growth factors; C57BL/6 mice

R 587.1

A

2095-5227(2015)12-1214-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.015

時間：2015-09-24 09:39:24

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150924.0939.002.html

2015-06-17

北京市自然科學基金項目(7132227)

Supported by the Beijing Natural Science Foundation of China (7132227)

趙華，男，在讀碩士。研究方向：應用內皮素受體拮抗劑治療糖尿病小鼠心肌纖維化的機制研究。Email: 977969009@qq. com

楊波，男，副主任醫師，副教授，碩士生導師。Email: dryangb@aliyun.com