細胞自噬在多發(fā)性創(chuàng)傷大鼠肺組織內(nèi)的變化

張桂通，李海鵬，劉 佳，郝 剛，李紹光，孫天勝

1解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2北京軍區(qū)總醫(yī)院 骨科，北京 100700

基礎研究論著

細胞自噬在多發(fā)性創(chuàng)傷大鼠肺組織內(nèi)的變化

張桂通1,2，李海鵬2，劉 佳2，郝 剛2，李紹光2，孫天勝2

1解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2北京軍區(qū)總醫(yī)院 骨科，北京 100700

目的觀察多發(fā)傷性創(chuàng)傷大鼠肺組織內(nèi)的變化，探討多發(fā)性創(chuàng)傷后急性肺損傷的相關機制。方法選取健康雌性SD大鼠56只，隨機分為假手術組(只在顱骨鉆孔，28只)和模型組(股骨干閉合骨折合并腦損傷，28只)。分別在術后6 h、12 h、24 h、48 h及5 d取大鼠右肺下葉組織，Real Time-PCR檢測各個時間點Beclin-1和LC3-Ⅱ基因的動態(tài)表達。結果在以上各個時間點，模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA水平較假手術組均明顯上調。術后48 h模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA水平(7.532±0.03，10.843±0.03)明顯高于假手術組(1.063±0.10，1.091±0.11)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結論自噬可能參與了股骨干骨折合并腦損傷這類嚴重多發(fā)傷后的急性肺損傷。

腦損傷；股骨干骨折；自噬；急性肺損傷；大鼠

股骨干骨折合并腦損傷為臨床常見嚴重多發(fā)傷，具有較高的死亡率。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是引發(fā)患者院內(nèi)死亡的主要原因[1-3]。即便不發(fā)生死亡，由此引起的肺部并發(fā)癥也會大大延長患者的住院時間并增加其經(jīng)濟負擔。目前，嚴重創(chuàng)傷后ALI的發(fā)生機制尚不十分清楚，給臨床上的針對性治療帶來很大的困擾[4]。以往的報道顯示，多發(fā)性創(chuàng)傷后肺組織的凋亡蛋白表達量顯著升高，且在肺泡上皮細胞內(nèi)可以觀察到凋亡小體的存在[5-6]。但是過表達抗凋亡蛋白Bcl-2或者抑制凋亡關鍵分子Caspase-3均未得到滿意的療效[7-9]。上述結果提示還有其他的細胞死亡方式參與了多發(fā)性創(chuàng)傷后的ALI。自噬是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，一般認為其在動物發(fā)育和維持組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用[10]。然而，越來越多的證據(jù)表明，當其調控機制出現(xiàn)紊亂，自噬會廣泛參與到各種疾病的病理進程當中[11-12]。那么這種細胞死亡方式是否也參與到多發(fā)傷后的ALI至今未見相關報道。本研究沿用課題組一直采用的股骨干骨折合并腦損傷大鼠模型，對其肺組織的細胞自噬水平進行檢測，旨在探討這類多發(fā)傷后ALI的分子機制，為臨床尋求新的治療手段提供理論基礎及實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物及分組 成年雌性SD大鼠56只，體質量230 ～ 300 g(軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供)。自然光照，自由食水，適應性飼養(yǎng)7 d。所有動物隨機分為假手術組和模型組(股骨干骨折合并腦損傷組)，每組28只。

2 模型制備 假手術組大鼠在額部顱骨鉆孔，保持硬腦膜完整。股骨干骨折合并腦損傷模型制備方法：參照Floyd等[13]方法，常規(guī)顱骨鉆孔后，連接HPD-1700型液壓打擊器，以2.0 atm的強度，制備閉合性顱腦損傷模型；而后參照Einhorn等動物骨折造模法支架理念，采用自制的骨折打擊器，制備閉合性股骨干骨折模型[14]。

3 實時熒光定量PCR檢測肺組織LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA的表達 兩組大鼠分別于術后6 h、12 h、24 h、48 h及5 d取大鼠左肺下葉組織100 mg，按Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，其引物片段：上游引物5’-CCCCCATGTTTGTGATG-3’，下游引物5’-GTGGTCATGAGCCCTTCCA-3’。檢測的目的基因Beclin-1引物序列：上游引物5’-CCGGAGACTCAAGGTCACTGA-3’，下游引物5’-AGCTCATCATCCAGCTCCAG-3’；LC3-Ⅱ上游引物5’-CGGAGCTTCGAACAAAGAGT-3’，下游引物5’-CCATTCACCAGGAGGAAGAA-3’。PCR擴增采用50μl的反應體系，加入cDNA模板5μl，ddH2O 32μl，PCR buffer(5×)10 μl，熒光探針0.5μl，Taq DNA聚合酶1μl，dNTPs 0.5μl，Beclin-1及LC3-Ⅱ上下游引物各0.5μl。擴增條件：1)95℃ 30 s；2)95℃ 5 s，60℃ 1 min 10 Cycles；3)95℃ 5 s，60℃ 30 s，35 Cycles。擴增產(chǎn)物分析：數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABIPrism 7300 SDS Software分析。Beclin-1和LC3-ⅡmRNA表達水平以它們與GAPDH的相對表達量表示。

4 透射電子顯微鏡觀測細胞內(nèi)自噬體 新鮮薄片肺組織經(jīng)2%戊二醛和1%鋨酸先后固定，丙酮濃度梯度脫水，再經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片，最后經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色各10 min。標本制備完畢在電子顯微鏡下觀察拍照。

結 果

1 股骨干骨折合并腦損傷誘導肺組織的自噬水平升高 與假手術組比較，模型組大鼠各個時間右肺組織中自噬標記物LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA水平均有升高，48 h達到高峰，5 d后仍高于假手術組(表1)。

2 股骨干合并腦損傷后肺組織內(nèi)自噬小體增多透射電子顯微鏡顯示，與假手術組比較，模型組大鼠肺部于48 h更易發(fā)現(xiàn)自噬小體，主要位于Ⅰ型肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞內(nèi)(圖1 ～ 圖4)。

表1 創(chuàng)傷后各時間點mRNA和LC3-ⅡmRNA的表達Tab. 1 Expression of Beclin-1 mRNA and LC3-ⅡmRNAat different time points after trauma ()

表1 創(chuàng)傷后各時間點mRNA和LC3-ⅡmRNA的表達Tab. 1 Expression of Beclin-1 mRNA and LC3-ⅡmRNAat different time points after trauma ()

GroupSham group (n=28)Model group (n=28)P Beclin-1 mRNA 6 h1.034±0.032.220±0.020.000 12 h1.124±0.124.346±0.020.000 24 h1.208±0.315.427±0.020.000 48 h1.063±0.107.532±0.030.000 5 d1.033±0.225.431±0.010.000 LC3-ⅡmRNA 6 h1.090±0.234.274±0.030.000 12 h1.092±0.107.088±0.020.000 24 h1.089±0.259.157±0.010.000 48 h1.091±0.1110.843±0.030.000 5 d1.092±0.309.666±0.010.000

圖 1 假手術組肺泡上皮細胞Fig. 1 Alveolar epithelial cell of rats in sham group

圖 2 模型組肺泡上皮細胞中的自噬小體Fig. 2 Alveolar epithelial cell of autophagosome of rats in model group

圖 3 假手術組血管內(nèi)皮細胞Fig. 3 Vascular endothelial cell of rats in sham group

圖 4 模型組血管內(nèi)皮細胞中的自噬小體Fig. 4 Vascular endothelial cell of autophagosome of rats in sham group

討 論

作為細胞程序性死亡的一種重要形式，細胞自噬近年來在各組織器官損傷領域受到廣泛關注。截至目前，學者們已在特發(fā)性肺纖維化、慢性阻塞性肺病等肺部疾病中證實了細胞自噬水平的改變[15]。但是自噬是否參與多發(fā)性創(chuàng)傷后的ALI，至今未見相關報道。本研究首次證實了股骨干骨折合并腦損傷這類多發(fā)性創(chuàng)傷可以誘導肺局部自噬標志性分子mRNA表達的上調，同時發(fā)現(xiàn)Ⅰ型肺泡上皮細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量的增多。以上證據(jù)提示自噬可能參與了股骨干骨折合并腦損傷這類多發(fā)傷后ALI的病理生理過程。

在既往的研究中，ALI期間肺泡上皮細胞的大量丟失已經(jīng)得到證實，而且其丟失程度與患者的臨床表現(xiàn)密切相關[16-17]。關于肺泡上皮細胞死亡的機制尚存在爭議。根據(jù)現(xiàn)有的證據(jù)，凋亡無疑是導致ALI時肺上皮細胞數(shù)量減少的重要原因[6]。本研究小組在前期的研究中也在股骨干骨折合并腦損傷大鼠模型的肺上皮細胞發(fā)現(xiàn)了凋亡小體的大量存在。但是針對凋亡的治療效果并不盡如人意，抗凋亡蛋白Bcl-2的過度表達或者凋亡關鍵分子Caspase-3的基因沉默均未得到滿意的療效，這提示我們，還有其他細胞死亡機制參與了多發(fā)性創(chuàng)傷后ALI的病理進程。

本研究中首次證實了股骨干骨折合并腦損傷這類多發(fā)傷可以導致肺部自噬水平的提高，但是導致肺泡上皮細胞發(fā)生自噬的原因需要更加深入的探討。本課題小組在之前的實驗中發(fā)現(xiàn)，上述模型的肺部存在大量浸潤的中性粒細胞及激活的巨噬細胞，同時炎癥介質濃度也顯著高于假手術組(數(shù)據(jù)中未顯示)。根據(jù)現(xiàn)有的證據(jù)，這些炎癥介質可以誘導細胞的凋亡，這可能是ALI期間肺泡上皮細胞發(fā)生凋亡的原因之一。此外，中性粒細胞大量蓄積會產(chǎn)生高濃度的活性氧，而活性氧與細胞自噬的激活密切相關[18]。深入揭示多發(fā)傷后ALI過程中細胞凋亡與自噬，及二者與炎癥反應之間的關系，有助于解釋ALI的病理生理機制。

總之，本實驗中發(fā)現(xiàn)的肺泡上皮細胞自噬水平的升高可能是由過度蓄積的炎癥細胞誘導，也可能同時存在其他誘因，有待進一步深入探討。同時，自噬在后ALI病理進程中的作用同樣需要進一步實驗的證實。本實驗小組將針對上述問題繼續(xù)開展一系列的動物實驗，以期為嚴重多發(fā)傷后ALI的臨床治療提供有力的理論基礎及實驗依據(jù)。

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Autophagic changes in lung tissues of rats with multiple trauma

ZHANG Guitong1,2, LI Haipeng2, LIU Jia2, HAO Gang2, LI Shaoguang2, SUN Tiansheng2
1Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China;2Department of Orthopedics, Beijing Army General Hospital, Beijing 100700, China

SUN Tiansheng． Email: suntiansheng-@163．com

ObjectiveTo investigate the changes of autophagy in lung tissues of rats with mutiple trauma．MethodsFifty-six Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into sham group (n=28) and model group (n=28)． The lower lobe of right lung were taken and the expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ mRNA in lung tissues of rats were measured by real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 5 d after trauma．ResultsCompared with the sham group, the expressions of LC3-Ⅱand Beclin-1 mRNA in model group increased significantly at different time points． Beclin-1 and LC3-Ⅱ of model group increased significantly than sham group at 48 hours after operation [(7．532±0．03) vs (1．063±0．10), (10．843±0．03) vs (1．091±0．11), P＜0． 01]．ConclusionAutophagy may be involved in multiple trauma of acute lung injury, like femoral shaft fracture combined with brain injury．

brain injury; femoral shaft fracture; autophagy; acute lung injury; rats

R 563.9

A

2095-5227(2015)12-1211-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.014

時間：2015-10-12 10:10:15

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151012.1010.002.html

2015-07-10

國際科技合作項目(2010DFA31250)

Supported by the International Technical Cooperation and Communication Project (2010FDA31250)

張桂通，男，碩士，醫(yī)師。研究方向：脊柱脊髓損傷。Email: zhanggt116114@163.com

孫天勝，男，博士，主任醫(yī)師，教授。Email: suntiansh eng-@163.com