免疫細胞治療對晚期胃癌患者外周血記憶T細胞的影響

李則學，張 蘭，李沛雨

解放軍總醫院 普通外科研究所，北京 100853

免疫細胞治療對晚期胃癌患者外周血記憶T細胞的影響

李則學，張 蘭，李沛雨

解放軍總醫院 普通外科研究所，北京 100853

目的初步研究免疫細胞治療對胃癌患者免疫記憶狀態的影響。方法2013年10月- 2015年2月在我院普通外科行胃癌根治術的253例患者按照是否經過樹突細胞、細胞毒性T淋巴細胞免疫細胞治療分組，其中免疫治療組72例，對照組181例，運用流式細胞術檢測患者外周血CD4+TCM(CD4+CD45RO+CD62L+)、CD8+TCM(CD8+CD45RO+CD62L+)、CD4+TEM(CD4+CD45RO+CD62L-)及CD8+TEM(CD8+CD45RO+CD62L-)比例，分析晚期胃癌患者免疫記憶狀態，并進一步分析免疫細胞治療對免疫記憶形成的影響。結果胃癌患者中，CD4+T細胞中以TCM為主，為54.52%±12.76%；而CD8+T細胞中以TEM為主，為24.49%±11.39%。相比對照組，免疫治療組外周血中CD8+TCM比例顯著降低(對照組31.59%±9.29%，免疫治療組24.26%±7.71%，P=0.025)，CD4+TCM比例顯著降低(免疫治療組47.86%±11.77%，對照組60.00%±11.05%，P=0.006)，CD8+TEM顯著升高(對照組20.00%±8.43%；免疫治療組29.93%±12.40%，P=0.013)。結論記憶T細胞可以有效評價胃癌患者抗腫瘤特異性免疫狀態，且免疫細胞治療可以有效重建胃癌患者抗腫瘤免疫記憶。

胃癌；T淋巴細胞亞群；記憶T細胞；免疫細胞治療

胃癌是消化道常見腫瘤，診斷時常為晚期，發病率和死亡率較高[1-4]。機體免疫紊亂是腫瘤發生發展的重要基礎，評估腫瘤患者免疫狀態是免疫治療腫瘤的前提，但免疫的復雜性導致評估困難，進而成為腫瘤免疫治療及療效監測的障礙。研究證實，記憶T細胞在晚期腫瘤發生發展中具有重要作用[5-6]，可以介導持久的抗腫瘤特異性免疫，其在腫瘤患者體內的維持水平與腫瘤患者免疫治療效果密切相關[6-7]。因此，本研究對胃癌患者外周血記憶T細胞特征進行分析，研究免疫細胞治療對胃癌患者外周血記憶T細胞的影響，探索免疫細胞治療恢復抗腫瘤免疫內在機制。

對象和方法

1 研究對象 2013年10月- 2015年2月在本院普通外科行胃癌根治術的253例患者，均經術后病理檢查確診，其中男165例，女88例，年齡23 ～ 84歲，平均52歲。接受手術聯合樹突細胞(dendritic cells，DC) + 細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)(CD8+CD45RO+CD62L+比例＞60%)治療的患者作為免疫治療組，共72例，僅接受手術治療的作為對照組，共181例，兩組患者年齡、性別、病理類型及分期、臨床分期及手術方式差異無統計學意義。見表1。

表1 兩組胃癌患者臨床資料比較Tab. 1 Clinical characteristics of immunotherapy group and control group (n, %)

2 免疫治療 術前采集外周血50 ml，分離培養擴增淋巴細胞，分別在術后9 d、12 d和14 d回輸DC細胞、CTL細胞。

3 外周血T細胞檢測 分別于術前1 d和術后1個月門診復查時采外周血5 ml用于檢測免疫記憶細胞。人淋巴細胞分離液購自中國醫學科學院生物所。PerCP標記抗人CD4單克隆抗體、FITC標記抗人CD8單克隆抗體、APC標記抗CD45RO單克隆抗體、PE標記抗人CD62L單克隆抗體均購自美國BD公司，胎牛血清(FBS)購自北京元亨金馬生物技術公司。取外周血20 ml，與等體積0.9%氯化鈉注射液混勻，鋪在等體積的分離液上，以2 300 r/min離心22 min；收集白膜層，用0.9%氯化鈉注射液洗滌1 ～ 2次，2 300 r/min離心10 min，棄上清后收獲細胞。取1×106個細胞，加入CD8-FITC/CD62L-PE/CD4-PerCP/CD45RO-APC抗體，混勻后常溫避光反應30 min，洗滌2次(1 200 r/ min，離心5 min)，懸浮于500μl PBS中，4℃保存。熒光抗體染色完成后，應用流式細胞儀檢測細胞，并用CellQuest軟件分析。

4 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，定量資料采用表示，兩個獨立樣本均數比較采用t檢驗，定性資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 胃癌患者術前免疫記憶狀態 根據T細胞表面分子CD45RO及CD62L的表達與否將T細胞分為兩種類型：CD45RO+CD62L+中央型記憶T細胞(TCM)和CD45RO+CD62L-效應型記憶T細胞(TEM)。對253例胃癌患者外周血中CD4+T及CD8+T細胞分群分析后，CD4+中央型記憶T細胞占54.52%±12.76%，CD4+效應型記憶T細胞占15.60%±10.17%，可見CD4+T細胞中以中央型記憶T細胞為主，占總數約60%。CD8+中央型記憶T細胞占28.28%±9.25%，CD8+效應型記憶T細胞占24.49%±11.39%。

2 免疫細胞治療對胃癌患者記憶T細胞的影響術后1個月時，兩組患者的外周血中CD4+TCM比例差異有統計學意義，免疫治療組47.86%±11.77%，對照組60.00%±11.05% (P=0.006)。免疫治療組CD8+TCM比例較對照組顯著降低，對照組31.59%± 9.29%，免疫治療組24.26%±7.71% (P=0.025) (圖1)。而免疫治療組CD8+TEM比例較對照組顯著升高，對照組20.00%±8.43%，免疫治療組29.93%± 12.40%(P=0.013)。見圖2。

圖 1 兩組胃癌患者CD4+TCM(CD4+CD45RO+CD62L+)和CD8+TCM(CD8+CD45RO+CD62L+)比較Fig. 1 Percentage of CD4+TCMand CD8+TCMin gastric cancer patients with or without treatment

圖 2 兩組胃癌患者CD4+TEM(CD4+CD45RO+CD62L-)和CD8+TEM(CD8+CD45RO+CD62L-)比較Fig. 2 Percentage of CD4+TEMand CD8+TEMin gastric cancer patients with or without treatment

討 論

新興的免疫治療已經成為抗腫瘤的第四大手段。免疫細胞是抗腫瘤免疫的重要組成部分，其中記憶性T細胞是體內持久存在的抗腫瘤組分，按照其不同的功能分為中央型記憶細胞TCM和效應型記憶細胞TEM[8]。TCM維持免疫記憶，在機體荷瘤或腫瘤轉移狀態下發揮免疫保護作用[9-10]，高表達CD45RO和CD62L，主要分布于淋巴結等次級淋巴器官等，而TEM低表達或不表達CCR7和CD62L，可以表達黏附分子和趨化因子受體，執行快速的效應功能，主要分布在免疫反應局部[11-12]，二者在抗腫瘤免疫都有重要的作用，但TCM相比TEM更有優勢[13-15]。

本研究分析了晚期胃癌患者外周血記憶性T細胞的分布，發現胃癌患者外周血中中央型記憶性T細胞相對較少，而效應型記憶性T細胞比例增加，呈現典型的T細胞耗竭狀態[16]，即中央型記憶細胞向效應型記憶細胞轉化，缺乏功能性T細胞。雖然效應型記憶性T細胞比例增加，但是缺乏輔助性T細胞，無法發揮有效的抗腫瘤作用[17]。TCM和TEM可以作為評估胃癌患者免疫狀態的有效指標，用于解釋腫瘤治療效果不佳的內在免疫機制，也可以評估各種治療方式，進而指導腫瘤治療方案的制訂，實現腫瘤的個性化治療。

基于T細胞的過繼免疫治療是腫瘤生物治療的重要手段，本研究中采用的DC和T細胞多細胞聯合免疫治療，將大量優質的腫瘤抗原致敏的T細胞(TCM＞60%)回輸體內，及時補充腫瘤患者體內TCM細胞，有效糾正胃癌患者術后免疫損傷狀態及T細胞耗竭狀態。

胃癌患者免疫狀態呈動態變化，以TCM和TEM為觀察指標，動態監測抗腫瘤特異性免疫狀態的變化，分析各種治療手段對免疫狀態的影響，探索建立優化、高效、個性化的抗腫瘤聯合治療方案，值得進一步研究。

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Effects of postoperative immunocytes therapy for memory T cell subsets in patients with advanced gastric cancer

LI Zexue, ZHANG Lan, LI Peiyu
General Surgery Institute, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Corresponding author: LI Peiyu． Email: lipeiyu6301@163．com

ObjectiveTo explore the effects of immunotherapy on immunological memory in patients with advanced gastric cancer．MethodsTwo hundred and fifty-three patients with advanced gastric cancer who underwent radical surgery in our hospital from October 2013 to February 2015 were enrolled in this study, and they were randomly divided into immunotherapy group (n=72) and control group (n=181) according to whether they had undergone immunotherapy, including dendritic cells (DC) and cytotoxic T cell (CTL)． Percentage of CD4+TCM(CD4+CD45RO+CD62L+), CD8+TCM(CD8+CD45RO+CD62L+), CD4+TEM(CD4+CD45RO+CD62L-) and CD8+TEM(CD8+CD45RO+CD62L-) in peripheral blood was evaluated to analyze immune memory characteristics of advanced gastric cancer patients, furthermore, influence of immunotherapy to immune memory was also analyzed．ResultsTCMaccounted for most of the CD4+T cells (54．52%±12．76%) while TEMin CD8+T cells accounted for (24．49%±11．39%)． Compared with control group, percentage of CD4+TCMand CD8+TCMin patients treated with immunotherapy decreased significantly (CD4+TCM: immunotherapy, 47．86%±11．77%, control, 60．00%±11．05%, P=0．006; CD8+TCM: immunotherapy, 24．26±7．71%, control, 31．59±9．29%, P=0．025), however, CD8+TEMincreased significantly (control, 20．00±8．43%, immunotherapy, 29．93±12．40%, P=0．013)．ConclusionMemory T cells can effectively evaluate the immune status of advanced gastric cancer, and immunotherapy can be effective in restoring immune depletion status of patients with advanced gastric cancer．

gastric cancer; T-lymphocyte subset; memory T cells; immunotherapy

R 392.9；R 730.3

A

2095-5227(2015)12-1169-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.002

時間：2015-10-20 10:29:18

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151020.1029.004.html

2015-08-04

國家自然科學基金面上項目(81172891)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81172891)作者簡介：李則學，女，學士，主管技師。研究方向：晚期腫瘤的免疫治療。Email: lizx301@sina.com

李沛雨，男，主任醫師，碩士生導師。Email: lipeiyu6301 @163.com