原發中樞神經系統淋巴瘤組織CXCR5及其配體CXCL13表達和意義

譚衛國，王文華，周幽心，杜子威

(1 昆山市中醫醫院神經外科，江蘇 昆山 215300； 2 蘇州大學附屬第一醫院)

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原發中樞神經系統淋巴瘤組織CXCR5及其配體CXCL13表達和意義

譚衛國1，王文華1，周幽心2，杜子威2

(1 昆山市中醫醫院神經外科，江蘇 昆山 215300； 2 蘇州大學附屬第一醫院)

目的 檢測趨化因子受體5 (CXCR5)及其配體CXCL13在原發中樞神經系統淋巴瘤組織表達水平,探討其在腫瘤發生發展過程中的可能作用。方法 分別采用免疫組化EnVision二步法和半定量RT-PCR方法，檢測CXCR5及CXCL13在5例原發中樞神經系統淋巴瘤組織和10例正常腦組織中的表達。結果 免疫組化結果顯示，CXCR5和CXCL13在腫瘤標本中陽性表達率均為100%(5/5)，在正常腦組織中陽性表達率均為0(0/10)；半定量RT-PCR檢測結果顯示，CXCR5和CXCL13在腫瘤標本中全部檢出，而在正常腦組織中均未檢出。結論CXCR5/CXCL13信號通路在原發中樞神經系統淋巴瘤的發生發展過程中起重要作用。

中樞神經系統腫瘤；淋巴瘤；受體, 趨化因子；CXCL13

原發中樞神經系統淋巴瘤(PCNSL)是少見的腦內非霍奇金淋巴瘤，主要累及大腦、軟腦膜、眼部及腦干，該病占原發顱內腫瘤的3%～4%，大部分為彌漫型大B細胞淋巴瘤[1]。中樞神經系統在正常情況下缺乏B淋巴細胞存在所需要的生理環境，PCNSL為什么會發生在中樞神經系統至今沒有明確結論。最近,趨化因子受體及其配體的作用日益受到研究者的關注,趨化因子受體5(CXCR5)及其配體CXCL13對淋巴細胞的趨化作用及對腫瘤細胞增殖等生物學行為影響的相關研究較多。本研究通過檢測CXCR5及CXCL13在PCNSL組織的表達水平, 探討其在腫瘤發生發展過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1標本來源

2010年1月—2012年6月，蘇州大學附屬第一醫院神經外科手術切除并由病理證實的PCNSL標本5例，其中男1例，女4例。5例病人血常規淋巴細胞計數及其占比均位于正常范圍，并均行骨髓穿刺檢查排除系統性淋巴瘤，HIV抗體檢測均陰性。對照組為正常腦組織標本10例，均來自腦外傷行手術治療的病人。部分標本用甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，切片厚度4 μm，待行免疫組化檢測；部分標本取下后，立即放入-187 ℃的液氮罐中保存，待行半定量RT-PCR檢測。

1.2CXCR5和CXCL13的檢測

1.2.1免疫組化檢測 采用免疫組化EnVision二步法，按試劑盒說明書操作。CXCR5、CXCL13以細胞膜、細胞質或細胞核內出現棕褐色顆粒為陽性，光鏡下隨機觀察8個高倍視野，計算陽性細胞百分比，陽性細胞百分比>10%為陽性。

1.2.2半定量RT-PCR檢測 按照Trizol說明書提取PCNSL及正常腦組織標本總RNA,紫外線分光光度計鑒定,根據260 nm處吸光度值計算RNA濃度。取總RNA 2 μg行逆轉錄,操作步驟參照試劑盒說明。以逆轉錄產物為模板,CXCR5、CXCL13和內參照GAPDH引物在同等條件下擴增，產物在凝膠電泳上出現目標條帶視為陽性。 CXCR5上游引物序列為5′-GGTCTTCATCTTGCCCTTTG-3′，下游引物序列為5′-ATGCGTTTCTGCTTGGTTC-T-3′；CXCL13上游引物序列為5′-CTCTGCTTCTCATGCTGCTG-3′，下游引物序列為5′-CAGCTTGAGGGTCCACACAC-3′； GAPDH上游引物序列為5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物序列為5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。 擴增條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40個循環；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳并進行拍照。

2 結 果

2.1免疫組化檢測

PCNSL組織CXCR5、CXCL13染色呈強陽性，腫瘤細胞的細胞膜、細胞質、細胞核中見明顯棕褐色顆粒，而正常腦組織中二者染色均陰性(圖1A～D)。CXCR5和CXCL13在PCNSL腫瘤標本中陽性表達率均為100%(5/5)，在正常腦組織中陽性表達率均為0(0/10)。

2.2半定量RT-PCR檢測

在全部腫瘤標本中均檢出CXCR5和CXCL13 RNA表達，而在正常腦組織中均未檢出CXCR5和CXCL13 RNA表達(圖2A、B)。

3 討 論

人類的趨化因子是由50個以上氨基酸組成的小分子分泌蛋白，這些分子主要作用是免疫調節、趨化作用和活化淋巴細胞。它們因鄰近N-端的保守半胱氨酸殘基的相對位置不同而被分為CXC、CC、C和CX3C等4個亞型。趨化因子受體是由細胞外配體結合區、7個跨膜區和胞內羧基末端組成的G蛋白耦聯受體(GPCR)。到目前為止，已發現19種存在于哺乳動物中的趨化因子受體，通常表達于免疫細胞、內皮細胞等細胞膜上。根據其所結合的配體可將趨化因子受體相應分為CXCR、CCR、CR和CX3CR。趨化因子和對應的趨化因子受體結合，可促進細胞增殖和移動[2]。

上世紀90年代, 在研究人伯基特淋巴瘤相關基因時發現了一種特殊的基因, 這也是第一種被發現的在淋巴細胞表面表達的GPCR，被命名為伯基特淋巴瘤受體1(BLR1)。BLR1與白細胞介素8(IL-8) 和其他中性粒細胞趨化因子的受體高度相關，與最近發現的HIV輔助受體CXCR4也有一定

A：PCNSL組織CXCR5染色；B：正常腦組織CXCR5染色；C：PCNSL組織CXCL13染色；D：正常腦組織CXCL13染色。免疫組化EnVision染色，400倍。

圖1 PCNSL組織和正常腦組織CXCR5及CXCL13表達

A為CXCR5電泳結果：①為正常腦組織，②～⑥為PCNSL組織；產物條帶位于230 bp。B為CXCL13電泳結果：①為正常腦組織，②～⑥為PCNSL組織；產物條帶位于200 bp。

圖2 CXCR5和CXCL13電泳結果

的相似性。根據趨化因子的命名原則， 將BLR1確定為CXCR5[3]。CXCL13是CXCR5的配體，主要分布在肝臟、血清、淋巴結和胃組織中，此外，在唾液腺和乳房組織中也有少量的分布，CXCL13編碼基因位于人染色體4q21。由于它具有吸引B細胞的能力，因此被稱為B細胞吸附因子1(BCA-1),或B細胞趨化因子(BLC)。根據趨化因子及其受體的系統命名法，因其受體為CXC族的趨化因子，因此被命名為CXCL13。

在淋巴器官中，大部分B細胞分布于淋巴組織濾泡中，其主要原因為淋巴濾泡中基質細胞上表達的CXCL13能趨化表達有CXCR5的B細胞移動、定位[4]。CXCR5及CXCL13在多種淋巴增生疾病中表達，與腫瘤形成及進展有關。HUSSAIN等[5]研究顯示，CXCR5與CXCL13信號通路在艾滋病相關非霍奇金淋巴瘤(AIDS-NHL)的發生以及生長過程中起作用。

本研究采用免疫組化方法和半定量RT-PCR進行檢測，結果顯示，CXCR5與CXCL13在腫瘤組織中均高表達，而在正常腦組織中則均無表達。說明CXCR5/CXCL13信號通路在PCNSL的病理過程中起重要作用。SMITH等[6]的研究表明，PCNSL中的惡性B淋巴細胞及血管內皮細胞表達B細胞趨化因子CXCL13。也有研究結果表明，CXCR5與其配體CXCL13相結合，激活了Akt和ERK1/2通路[7]，而該通路與淋巴細胞活化及腫瘤細胞增殖、凋亡密切相關。由此我們認為，CXCR5/CXCL13信號通路在PCNSL中有促進腫瘤增殖的作用。

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[6] SMITH J R, BRAZIEL R M, PAOLETTI S, et al. Expression of B-cell-attracting chemokine 1 (CXCL13) by malignant lymphocytes and vascular endothelium in primary central ner-vous system lymphoma[J]. Blood, 2003,101(3):815-821.

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(本文編輯 馬偉平)

EXPRESSIONS OF CXCR5 AND ITS LIGANDS CXCL13 IN PRIMARY CENTRAL NERVOUS SYSTEM LYMPHOMA

TANWeiguo,WANGWenhua,ZHOUYouxin,DUZiwei

(Department of Neurosurgery, Kunshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunshan 215300,China)

ObjectiveTo detect the expressions of chemokine receptor CXCR5 and its ligands-chemokine CXCL13-in primary central nervous system lymphoma (PCNSL) and their possible role in the occurrence and development of this disease.MethodsApplying immunohistochemical and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), the expressions of CXCR5 and CXCL13 in five cases of PCNSL and 10 cases of normal brain tissue were detected.ResultsImmunohistochemistry indicated that the expressions of CXCR5 and CXCL13 in tumor tissue were 100%(5/5), and 0 in normal brain tissue; RT-PCR showed CXCR5 and CXCL13 were all positive in the tumor tissue, and that in the normal brain tissue were negative.ConclusionCXCR5/CXCL13 signaling path plays an important role in the pathogenesis of primary central nervous system lymphoma.

central nervous dystem neoplasms; lymphoma; receptors, chemokine; CXCL13

2014-05-19;

2014-07-30

譚衛國(1978-)，男，碩士，主治醫師。

R739.4

A

1008-0341(2015)01-0034-03