免疫熒光技術(shù)在檢測精子中PKA蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

張孝清++曹國弟++孫子龍

摘要：為了探測精子中蛋白激酶A（PKA）的定位表達(dá)，通過飼養(yǎng)8只性成熟昆明雄性小鼠，49天后采集其精子制備精子懸液，涂片。用PKA多克隆抗體與精子進(jìn)行免疫試驗(yàn)，陰性對照組用PBS取代，然后用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記。用熒光顯微鏡鏡檢，結(jié)果顯示精子中PKA蛋白的表達(dá)部位主要為精子尾部的主段和中段。

關(guān)鍵詞：免疫熒光技術(shù)；小鼠；精子；PKA

中圖分類號：Q492.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）12-0005-02

作為畜牧業(yè)大國的中國，家畜的繁殖直接影響到畜牧業(yè)的順利和健康發(fā)展。而在家畜繁殖中，精子的質(zhì)量又是影響家畜繁殖的直接因素，精子蛋白質(zhì)質(zhì)量或數(shù)量的變化往往是精子的結(jié)構(gòu)或功能異常的表現(xiàn)，因此，對家畜精子的蛋白質(zhì)組成及變化的全面了解將有助于探討精子發(fā)生、分化及精卵相互識別與結(jié)合的生理病理機(jī)制。

蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）作為精子中的一種蛋白激酶，可以通過磷酸化激活多種酶，直接影響精子蛋白的功能，在精子的成熟、運(yùn)動和受精過程中發(fā)揮著重要作用[1]。因此，通過對精子中PKA的研究，有望從蛋白質(zhì)整體水平了解精子的發(fā)生及受精機(jī)制。

目前蛋白質(zhì)的檢測分為定量檢測和定位檢測。蛋白質(zhì)的定位檢測有免疫熒光技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)。熒光抗體技術(shù)又稱免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique），是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)，IFA始創(chuàng)于20世紀(jì)40年代初，由Coons等（1941年）首次采用熒光素標(biāo)記抗體檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原并獲得成功。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷與檢測。本試驗(yàn)用免疫熒光技術(shù)對小鼠精子PKA蛋白的定位表達(dá)，為以后進(jìn)一步研究精子PKA蛋白的功能提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

多聚甲醛（AR）、PKA多克隆抗體、BSA、TritonX-100、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗；生物顯微鏡、圖像分析軟件（Image-Proplus v.5.1）、HPS-250生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動物 8只性成熟昆明雄性小鼠，體重20 g左右，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，均為普通級動物。供試小鼠分籠飼養(yǎng)，飲用去離子水，并飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，整個(gè)試驗(yàn)期間所有小鼠均自由采食和自由飲水的飼養(yǎng)方式。49 d后[（40±2） d為一個(gè)精子發(fā)生周期]，取出小鼠附睪尾部及輸精管，用針頭沖出精子，放入1.5 mL EP管中，在二氧化碳培養(yǎng)箱孵育10 min，獲取純凈的精子懸液，涂片，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光組織化學(xué)試驗(yàn) 37 ℃用PBS洗精；添加含4%多聚甲醛的PBS固定（37 ℃，30 min）；用含0.05 mol/L氨基乙酸的PBS洗3次；100 μL精子懸液涂片；用0.2%TritonX-100的PBS浸10 min，后3×3次/minPBS沖洗；3%BSA的PBS封閉（37 ℃，1 h）；用1：100的一抗4 ℃孵育過夜，之后37℃ 2 h（陰性對照不加一抗，用PBS取代）；用4 ℃的PBS清洗3次，每次5 min，吹干；1：200的二抗（FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗溶于1%BSA-PBS）37 ℃ 1 h；PBS洗3次，3～5 min/次，多余的濾液吹干；封片（緩沖甘油封片劑）；最后用熒光顯微鏡鏡檢。

2 結(jié)果與分析

陰性對照組在普通光學(xué)顯微鏡明場下結(jié)果見圖1，熒光顯微鏡下結(jié)果見圖2；試驗(yàn)組在普通光學(xué)顯微鏡明場下結(jié)果見圖3，熒光顯微鏡下如圖4。圖5為圖3和圖4的合成圖。

結(jié)果顯示精子中PKA蛋白的表達(dá)部位為精子尾部的主段和中段。

3 討論

3.1 PKA蛋白的生物功能及在精子中的作用

PKA全酶包括4個(gè)亞基 （R2C2），兩個(gè)相同的調(diào)節(jié)亞基（R）和兩個(gè)相同的催化亞基（C），R亞基有兩個(gè)cAMP結(jié)合位點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)功能。在細(xì)胞內(nèi)cAMP是重要的第二信使物質(zhì)，在細(xì)胞的跨膜信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著信號放大和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要作用。PKA是第二信使的直接靶酶，通過磷酸化或去磷酸化作用[2]，控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其他酶類或蛋白質(zhì)的活性，介導(dǎo)cAMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，PKA為依賴cAMP的蛋白激酶，主要作用是傳遞細(xì)胞激外刺激信號、影響膜蛋白的磷酸化而改變細(xì)胞膜的通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等，它們均是通過使各自的底物磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、生長和增殖。

cAMP/PKA 信號通路：cAMP/PKA 這條信號通路通常被認(rèn)為是調(diào)節(jié)哺乳動物精子運(yùn)動的一條極為重要的途徑[3]。在哺乳動物精子獲能過程中，這條信號通路還被認(rèn)為是胞內(nèi)信號傳遞的主要通路。胞外刺激信號與精子表面受體結(jié)合后，通過GTP結(jié)合蛋白（G蛋白）傳遞給腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC）使其活化。維持精子活力重要的過程是激活PKA后催化精子鞭毛蛋白磷酸化。通過cAMP/PKA 和鈣離子信號通路的共同作用，可使精子胞體內(nèi)cAMP 水平迅速上升，從而上調(diào)精子鞭毛發(fā)生劇烈的波動，導(dǎo)致精子超激活運(yùn)動[4]。

3.2 精子中PKA蛋白的表達(dá)

PKA蛋白的表達(dá)在精子各部都有，可以推測PKA蛋白參與精子大多數(shù)生理活動（如精子的成熟、運(yùn)動和頂體反應(yīng)等），說明PKA蛋白在精子活動中起著非常重要的作用，影響著精子的活力。

4 小結(jié)

免疫熒光技術(shù)以其高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)用于蛋白質(zhì)的檢測。本試驗(yàn)用熒光顯微鏡鏡檢，結(jié)果顯示精子中PKA蛋白的表達(dá)部位主要為精子尾部的主段和中段。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 揚(yáng).蛋白激酶A對精子頂體反應(yīng)和活力的影響[J].中國男科學(xué)雜志，2002（1）：63-65.

[2] 周思暢，等.獲能期間精子蛋白的酪氨酸磷酸化[J].生命科學(xué)，2006，18（3）：285-289.

[3] 李 揚(yáng).環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信號傳導(dǎo)通路對精子運(yùn)動功能調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2005.

[4] 李 楊，劉繼紅.雙丁酰環(huán)磷酸腺苷對人精子運(yùn)動功能的影響[J] .中華男科學(xué)，2002，8（6）：398-400.