無菌結晶原料藥工藝模擬試驗研究

□ 劉永麗

根據藥品生產質量管理規范(2010年修訂)，無菌原料藥工藝是指法定標準中列有無菌檢查項目的原料藥，應最大限度地控制微生物［1］。無菌結晶原料藥是指采用結晶精制工藝進行生產的非最終滅菌原料藥，其生產工藝通常為粗品溶解后經過除菌過濾進入結晶釜結晶，過濾烘干后進行分裝，且還包括輔助工序。無菌結晶原料藥的工藝模擬試驗(Process simulation validation)通常是指使用合適的空白物料或微生物生長培養基，運用與無菌物料生產方法相接近的方法評估無菌工藝。［7］無菌工藝模擬試驗確定無菌工藝生產系統是否有染菌風險，即培養基模擬灌裝試驗［1］。

一、無菌結晶原料藥生產工藝分析

無菌結晶原料藥的生產流程包括液體和固體兩個階段，粗品溶解后經過除菌過濾進入結晶釜的結晶、過濾、烘干等過程為液體階段，烘干物料的分裝為固體階段。無菌工藝模擬試驗工藝應涵蓋溶液通過除菌過濾器后至分裝結束，但不涵蓋粗品的溶解過程。

二、無菌工藝模擬試驗前的準備

在無菌工藝驗證前，對其生產設備的設計和確定有著十分重要的意義［3］。無菌工藝模擬試驗前應確保生產設施設備、公共系統、儀器儀表、人員等均已經過確認并在確認有效期內，并保證無菌工藝模擬試驗期間的正常運行。

(一)生產設施確認。一是潔凈區高效泄露測試合格;二是層流區域煙霧測試確認氣流流向未紊亂;三是從潔凈區消毒效果和潔凈級別應能滿足操作要求，并確定監控方案對環境進行監測;四是潔凈區溫濕度滿足產品生產要求，并使人員穿著無菌衣舒適。

(二)公共系統確認。一是確認水系統(包括純化水系統和注射用水系統)的安裝和供水質量滿足生產需求;二是確認直接接觸產品或無菌設備的壓縮空氣系統、氮氣系統滿足生產要求，包括微粒、微生物等;三是確認純蒸汽系統能夠滿足生產需要，如設備和無菌衣的滅菌、直接接觸產品的包裝材料和工器具的滅菌等。

(三)設備確認。一是確認生產設備性能滿足產品生產要求;二是確認生產設備材質和設計滿足清潔要求;三是確認生產設備滅菌效果能滿足要求，無滅菌死角;四是確認設備的密閉性能滿足設計要求，并經過泄漏測試合格。

(四)儀器儀表校驗。一是確認儀器儀表均經過校驗并在校驗有效期內;二是儀器儀表精度和型號滿足生產要求。

(五)除菌過濾器。確認除菌過濾器效果經過驗證，包括過濾器材質與產品的兼容性，過濾效果確認，過濾器的完整性測試等。

(六)無菌生產工藝。無菌生產工藝流程和工藝參數，各工序操作時限等均已確認，并評估確認最差條件。

(七)人員。一是無菌操作人員已經過資質確認，包括GMP知識、微生物知識、無菌操作培訓、無菌更衣確認等;二是無菌操作人員數量和職責確認;三是無菌操作區域管理人員資質和職責確認;四是QC取樣和過程監測人員資質和職責確認;五是QA過程監控人員資質和職責確認;六是維修人員資質和職責確認。

三、模擬介質的選擇

為了保證無菌工藝模擬試驗結果的可信性，應根據生產工藝和生產環境選擇適當的模擬介質。模擬介質應具備以下要求:一是對微生物生長無抑制作用，且能夠促進微生物生長。二是模擬介質在培養基溶液中要有較好的溶解度。模擬介質最終會與培養基溶液進行混合培養，培養結果通常是通過觀察培養基溶液的澄清度進行判定。三是模擬介質不能影響培養基溶液的促生長效果。需要對模擬介質加入培養基溶液后溶液的促生長效果進行確認，確定其不影響培養基溶液的質量。四是模擬介質應易于清洗，并對設備沒有腐蝕性［6］，無毒，不污染環境。每次無菌工藝模擬試驗后均應對設備進行徹底清洗，并確認清洗效果。

四、培養基的選擇

(一)培養基種類選擇。通常應根據微生物種類選擇培養基。若工藝中存在厭氧菌，可選擇硫乙醇酸鹽液體培養基。但通常產品的生產工藝與空氣接觸，適合大多數微生物的生長，污染厭氧菌的幾率較小。試驗用培養基應能夠支持較寬的微生物生長的菌譜，能促進革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母菌和霉菌的生長。通常選擇常用的TSB(Tryptic Soy Broth大豆胰蛋白培養基)作為模擬試驗用培養基。

(二)培養基濃度選擇。作為培養的TSB培養基溶液通常選擇常用的微生物檢測濃度，如3%TSB培養基溶液，以保證培養基溶液的促生長效果。若選擇其他濃度，需要確認在該濃度下培養基的溶解性以及對微生物的促生長能力的影響。

五、模擬介質的滅菌

模擬介質若本身受到污染或滅菌不徹底，會導致無菌工藝模擬試驗呈現假陽性結果。因此，要確保模擬介質的無菌性。在進行無菌工藝模擬試驗之前，需要對模擬介質進行取樣檢測其無菌性。

(一)無菌工藝液體階段模擬介質的除菌。無菌工藝液體階段模擬介質可采用除菌過濾器進行除菌，過濾器的選擇可根據模擬介質的性質進行調整。若無菌工藝使用的是疏水性過濾器，而模擬介質溶液為水溶液，可將無菌工藝使用的疏水性過濾器更換為適合模擬介質溶液的親水性過濾器。過濾器的除菌能力不需要通過無菌工藝模擬試驗進行驗證，因為過濾器的除菌能力已經通過挑戰性試驗確認，且其滅菌條件也經過了滅菌工藝驗證。

(二)無菌工藝固體階段模擬介質的滅菌。無菌固體滅菌方法很多，包括伽馬射線滅菌、濕熱滅菌等等。無論采用何種滅菌方法，都需要對滅菌效果進行確認，以保證模擬介質的無菌性。也可采用市售的無菌模擬介質固體，但該模擬介質供應商應經過資質確認，確保其提供模擬介質的無菌性。

六、培養基的滅菌

培養基的滅菌同模擬介質一樣，若企業自行滅菌，均需要對滅菌工藝進行驗證。對于滅菌后的培養基溶液，均需要進行促生長試驗。促生長試驗可采用接種枯草芽孢桿菌和白色念珠菌，接種量均少于100CFU，在20～25度培養3天，再在30～35度培養2天，各管培養基中接種微生物均應明顯生長。

七、無菌工藝模擬試驗工藝的設計

無菌工藝模擬試驗工藝設計應綜合考慮生產線可能發生污染的各種因素［4］，并避免不利于微生物生產的因素。模擬試驗過程參數的選擇如下:

(一)溫度。無菌原料藥結晶工藝通常包括升溫和降溫過程，考慮對微生物的生長影響，建議在整個模擬過程采用易于微生物生產的溫度，如25～30℃，避免高溫或低溫等影響微生物生長的環境。在溶解階段，考慮模擬介質的溶解速度，可采用加溫的方式加快模擬介質的溶解速度，但在壓濾進入結晶釜前，應將溶液降溫至適當的溫度(25～35℃)，以確保溶液溫度不影響無菌段可能的微生物的生長。

(二)壓力。對于抽真空工藝，考慮微生物在缺氧情況下影響其生長的因素，因此可采用模擬抽真空的動作，即抽真空至需要的真空度后，保持一定時間后，進行破真空，使設備內達到常壓，確定抽真空操作對無菌生產的影響。抽真空的次數根據工藝要求而定，通常不少于工藝要求次數。對于加壓操作，若工藝采用壓縮空氣進行加壓，可模擬工藝過程;若工藝采用潔凈氮氣進行加壓，則需要將氮氣更換為壓縮空氣。氮氣通常通過氣體除菌過濾器進入設備，替代的壓縮空氣也要通過相同的氣體除菌過濾器進入設備，以保證氣體除菌過濾器后的氣體管道也被覆蓋到。

(三)過程取樣和加料操作。根據生產要求，在生產過程中的取樣操作必須在無菌工藝模擬試驗中進行模擬。即采用與生產相同的操作進行取樣。取樣獲得的樣品不能丟棄，需要保留進行無菌檢查。若生產過程中存在加料操作，可采用模擬介質代替晶種，模擬加晶種的操作，以確認該操作不會影響產品的無菌性。

(四)操作時限。無菌工藝模擬試驗必須達到或超過產品生產工藝的最長條件。如結晶時間、過濾時間、干燥時間、分裝時間、無菌包裝材料的存放時間等，尤其是產品暴露在環境中的時間。這些在設計無菌工藝模擬參數時必須進行考慮。

(五)模擬介質的數量。模擬介質的數量應考慮對設備表面的全覆蓋，至少大于產品生產工藝的數量。

(六)其他參數的選擇。對于參數的選擇原則是不影響微生物的生長，并能夠模擬生產過程中可能存在無菌風險的操作。如結晶過程中的攪拌操作，攪拌速度過快對微生物操作有影響，且其可能存在無菌風險，因此在模擬時，應確定攪拌速度，若生產時要求攪拌速度較快，可在模擬時攪拌較短時間后，降低攪拌速度，或間歇攪拌。若溶解結晶采用的是有機溶劑，考慮有機溶劑對微生物生長的影響，可將有機溶劑調整為水溶液。

八、干涉活動及樣品取樣

無菌工藝模擬試驗必須考慮生產過程中可能出現的非正常操作，如抽真空的真空泵突然停止、分裝過程中包裝容器翻倒、分裝數量調整等。這些非正常操作可通過實際操作進行積累，在定期的無菌工藝模擬試驗中進行模擬。模擬的次數根據實際發生概率而定。每次模擬涉及的樣品根據需要進行取樣標識，評估其對無菌操作的影響。如分裝過程中出現容器側翻，認為調整后進行分裝，若該包裝最終污染，且確認為該操作引起的，在實際生產中發生該操作，則需要采用其他方式處理，如丟棄該包裝容器。

九、環境監測

為確保無菌工藝模擬試驗的可靠性，在模擬試驗過程中需要對環境進行監測，包括潔凈區懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、設備表面菌、人員表面菌。對潔凈區的環境監測不應少于日常的環境監測，尤其是對無菌區域的監測，需要考慮環境取樣對無菌操作的影響。無菌工藝模擬試驗應盡可能在惡劣的環境下進行，通過將操作人數增加到最大來達到此目的。在環境監測過程中，所有產品暴露操作的環境都需要進行監控。［5］

十、樣品培養和結果檢查

樣品的培養要求對樣品進行全培養，不能隨意丟棄樣品，除非樣品明顯被污染，且污染的原因很明確。

(一)液體階段樣品。采用液體介質進行培養時，若溶液量較小，可采用將所有溶液分裝并加入無菌培養基的方式進行培養。但通常的商業化生產中，溶液量均較大，將溶液分裝并加入培養基的過程中，很難不對溶液造成污染，造成假陽性試驗。可參照無菌檢查的方式，采用除菌過濾器對溶液進行全過濾后，對除菌過濾器進行培養。除菌過濾器至少采用0．45um級除菌過濾器。過濾結束后，將除菌過濾器在無菌環境下進行外表面消毒，將過濾器內殘留溶液放入無菌容器，過濾器也取出放置在無菌容器中，加入預先滅菌的培養基溶液，密封后進行培養。

(二)固體階段樣品。固體階段采用固體模擬介質模擬分裝過程，將模擬介質分裝如包裝容器后加入預先準備的滅菌后培養基溶液，密封振搖后，進行培養。加入培養基溶液后，其量至少是容器裝量的2/3，在培養過程中翻轉容器即可保證對容器的全覆蓋。應取2件進行陽性試驗，確認在該條件下微生物能夠生長。

(三)樣品培養結果檢查。無菌工藝模擬試驗樣品需進行全培養，培養條件應與無菌檢驗條件相同，即先在較低溫度(20～25℃)下培養7天，然后在較高溫度(30～35℃)下培養7天。考慮從較低溫度到較高溫度的升溫過程，可適當延長較高溫度的培養時間。

對于液體階段的過濾器，可先將過濾器振搖、翻轉，聞培養基的氣味是否為培養基特有的淡淡的氣味;如果長菌，會有有別于無菌培養基的臭味。觀察培養基溶液外觀是否為黃色清亮透明;如果長菌，黃色會變淺，溶液渾濁、不透明。如果長霉菌，培養基溶液會澄清，溶液內會漂浮著朵狀霉菌菌落。取出過濾器，再用手電筒照射檢查過濾器殼內是否有遺漏的菌斑。每支濾芯外表面用“菌落計數器”仔細照射檢查。濾芯內表面用手電筒照射檢查。無菌的濾芯濾紙表面應略有發黃，顏色淺，色澤均勻。長菌的濾芯會有菌斑，發黑，呈點狀，不均勻的。

對于固體階段的培養容器，可將容器振搖、翻轉，打開后，將培養基溶液倒入到無菌透明PE袋內。立即觀察外觀性狀。再用手電筒照射檢查鋁聽、膠塞內表面是否有遺漏的菌斑。

(四)培養結果判定。若發現污染應對微生物污染的樣品進行鑒別試驗，鑒別的內容至少應包括菌落、細胞形態學及革蘭染色特性等。

(五)試驗樣品培養基促生長試驗。對于樣品的檢查應在無菌環境下進行，在液體階段和固體階段培養樣品合格的情況下，還需要對培養后的培養基取樣進行微生物促生長試驗，以確定培養基的促生長能力，以免出現假陰性結果。

十一、無菌工藝模擬試驗結果評價

(一)合格結果判定。一是批生產操作涵蓋模擬設計中列出的最差條件;二是培養基促生長試驗合格;三是過程樣品檢查符合檢測要求;四是所有培養產品無污染;五是環境監測合格。

(二)失敗結果調查。若試驗有污染，應調查:一是生產環境微生物監測數據;二是生產環境懸浮粒子監測數據;三是人員污染的監測數據;四是HEPA過濾器的完整性檢測、粒子、風速等;五是操作間的空氣流向、壓差;六是操作人員的操作方法、培訓情況;七是模擬試驗過程中的異常情況;八是無菌室生產工具及其他用品的儲存狀況;九是鑒別污染微生物的種、屬，以尋找污染源的線索;十是無菌室的清潔、清潔堆規程的培訓及執行情況;十一是無菌生產用設備的控制系統和監測系統的校正;十二是生產前、生產后過濾器的完整性檢測結果;十三是相關產品、相關生產過程存在的問題等。

原因調查結束后，應根據調查所確定的或可能發生的原因制定糾正或改進方案并予以實施，并評估對已經生產產品無菌性的影響。當改進方案實施之后應重復模擬試驗。

十二、無菌工藝模擬試驗方案和報告

無菌工藝模擬試驗應制定方案，并在實施后形成報告，內容至少包括以上內容。在無菌工藝模擬試驗后，還需要進行清潔效果確認，以保證模擬試驗介質不會污染生產設備和環境。

［1］國家食品藥品監督管理局藥品認證中心．藥品GMP指南·無菌藥品［M］．北京:中國醫藥科技出版社，2011，8:1

［2］翟鐵偉．無菌原料藥的無菌工藝驗證［J］．醫藥工業設計雜志，2004，25(4):31 ～34

［3］張鳳．無菌原料藥的無菌工藝驗證［J］．科技創業家，2014，4(下):216

［4］李妮，劉智勇．新版GMP中對無菌工藝驗證要求的探討［J］．設備驗證與 GMP，2011，12(12):20 ～24

［5］薛紅霞，劉敏，林巍．無菌原料藥的無菌工藝驗證［J］．河北企業，2013，7:133 ～134

［6］梁書臣，張素霞，劉樹林等．無菌原料藥的無菌工藝驗證探討［J］．工藝探討與系統設計，2009，1(1):44～48

［7］梁毅，賀聰．無菌原料藥生產工藝驗證過程的研究［J］．中國藥房，2012，23(41):3849 ～3852

［8］美國FDA-無菌工藝生產無菌產品工業指南-cGMP(2004-9)

［9］PDA_TR No．28:Process Simulation Testing for Sterile Bulk Pharmaceutical Chemicals，2006

［10］PDA_TR No．22:Process Simulation for Aseptically Filled Products，2011