金黃色葡萄球菌誘導大鼠乳腺炎模型的建立

王 亨 ，余光濤，顧銘杰，于 惠，張 軍，王 艷，王培莉，林 宇，孟 霞，李建基

（1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州225009 ；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009）

奶牛乳房炎是影響奶牛生產性能的重要疾病，可導致產奶量急劇下降，嚴重者可引起敗血癥，甚至死亡，造成巨大的經濟損失。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌是導致乳腺炎的最常見的3 種細菌[1]。其中，金黃色葡萄球菌雖然不是典型的胞內寄生菌，但是該病原可以通過內在化進入宿主細胞，形成生物膜，在上皮細胞、巨噬細胞中生存，躲避抗生素的治療，難以控制和清除，形成亞臨床或慢性感染[2]。建立金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺的動物模型，對于研究感染和逃避機制，機體抵抗感染的先天性免疫機制，以及為治療藥物的開發都具有重要意義。鑒于此，該試驗進行了金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺模型的研究。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器 營養肉湯培養基和瓊脂培養基，購自中國醫藥集團化學試劑有限公司；戊巴比妥鈉，購自Sigma 公司；高速冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；動物血球分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；光學顯微鏡（Nikon，日本）；隔水式電熱恒溫培養箱和培養搖床（上海新苗醫療器械制造有限公司）；自制大鼠通乳針。

1.2 試驗動物及分組 體重為275±25 g 同齡妊娠Wistar 大鼠84 只（由揚州大學比較醫學中心提供），隨機分為試驗組和對照組（n=42）。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌，分離自臨床乳房炎病例，由揚州大學獸醫外科教研室保存。

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌的培養與計數 將保存的細菌接種營養瓊脂固體培養基，37 ℃培養18 h，挑取單菌落接種營養肉湯，37 ℃，160 r/min，培養24 h。離心菌液，并用無菌生理鹽水洗滌2 次后，制成細菌懸液，采用平板計數法計數，菌液放置于4 ℃冰箱備用。使用時，調整菌液濃度為2×107CFU/mL。

2.2 接種方法 于產后4 d 接種細菌。試驗組用通乳針經乳頭管將濃度為2×107CFU/mL 菌液接種第4 對乳腺(雙側)，每側0.1 mL。灌注后輕柔按摩。對照組注射等量的無菌生理鹽水，其他操作同試驗組。

2.3 樣品采集及處理 分別在0 h（灌注前）和灌注后6、12、24、48、72 h 和96 h，取試驗組和對照組大鼠各6 只，觀察臨床癥狀，感觸乳房溫度。麻醉后分離鼠膝部第四對乳腺，觀察乳腺組織的形態，無菌取乳腺組織用于乳腺中的細菌計數；另取一份置于中性福爾馬林中固定，做組織學檢查。采集抗凝血用于血常規檢測。稱量脾和胸腺的重量，檢測臟器指數。

2.4 乳腺組織中金黃色葡萄球菌的計數 將乳腺組織放入無菌的勻漿器中，加入生理鹽水（1 mL：100 mg），研磨后轉移至15 mL 離心管中，10 000 r/min（4 ℃）離心5 min，棄上清，加入等體積的生理鹽水重懸，重復以上操作，然后采用平板計數法計數。

2.5 數據處理 應用SPSS19.0 軟件對數據進行顯著性分析，統計結果以平均值±標準誤表示。以“*”表示差異顯著，P＜0.05，以“**”表示差異極顯著，P＜0.01。

3 結果

3.1 臨床癥狀及組織學檢查結果 試驗組大鼠注菌后精神沉郁，飲食欲較注菌前減退，乳房局部增溫。注菌12 h 后，剖檢眼觀即可見乳腺腫脹、充血（見中插彩版圖1，A）。組織學變化：注菌前乳腺腺泡結構完整，小葉間結締組織排列整齊（見中插彩版圖1，B）；注菌后6 h，腺泡內粒細胞增多，基質中炎性細胞浸潤（見中插彩版圖1，C）；注菌后12 h，腺泡內大量粒細胞浸潤，并伴有漿液性滲出，腺泡內現脫落壞死的上皮細胞。毛細血管擴張，基質內粒細胞浸潤（見中插彩版圖1，D）；注菌后24 h，炎性細胞繼續增多，廣泛分布于腺泡和小葉間結締組織，腺泡上皮細胞脫落、壞死（見中插彩版圖1，E）；注菌后48 h，腺泡結構進一步受到破壞，結構不清（見中插彩版圖1，F）；注菌后72 h，乳腺腺泡受到嚴重破壞，填充大量壞死組織（見中插彩版圖1，G）；注菌后96 h，乳腺腺泡萎縮，炎性細胞減少，結締組織增生（見中插彩版圖1，H）。對照組乳腺剖檢和組織學無明顯變化。

3.2 乳腺組織中感染細菌量的檢查結果 大鼠乳腺注菌6 h，乳腺組織內金黃色葡萄球菌顯著升高，后開始下降，12、24、48、72 h 和96 h 時間點較注菌6h 細菌數目均極顯著減少（P＜0.01）（見表1）。對照組注射生理鹽水前后，乳腺組織內均未分離到細菌。

3.3 胸腺和脾臟臟器指數檢查結果 試驗組，胸腺指數在注菌后6、12、24、72 h 和96 h 較0 h 極顯著升高（P＜0.01），48h 較0 h 顯著升高（P＜0.05）；脾臟指數在6、24 h 和72 h 較0 h 極顯著升高（P＜0.01），在12 h 和96 h 脾臟指數 較0 h 顯著升 高（P＜0.05）。對照組，胸腺和脾臟指數均未見顯著變化（P＞0.05）（見圖2，3，4）。

表1 試驗組乳腺組織中金黃色葡萄球菌數目的變化

圖2 胸腺指數的變化

圖3 脾臟指數的變化

3.4 外周血嗜中性粒細胞數的檢測結果 與0 h相比較，注菌后6 h，嗜中性粒細胞數迅速升高，在6 h 和12 h 較0 h 極顯著升高（P＜0.01）；對照組注射生理鹽水后各時間點，嗜中性粒細胞數均無顯著變化（P＞0.05）（見圖4）。

圖4 外周血嗜中性粒細胞總數的變化

4 討論

乳房炎的動物模型，最早是在1970 年由Chandler[3]建立的小鼠細菌性乳房炎模型。之后眾多學者采用該動物模型進行細菌性乳房炎、疫苗開發及藥物治療研究[4-6]。小鼠乳腺動物模型雖然成功復制了奶牛乳腺炎，但細菌接種需要借助放大鏡，且需切除部分乳頭，存在感染風險[3]。鐘凱等[7]在小鼠乳房炎模型的基礎上，通過乳頭管灌注內毒素誘發大鼠的乳腺炎。張書起等[8]通過大腸桿菌接種大鼠乳腺，成功誘導了大腸桿菌性乳腺炎。

由于大鼠的體型較小鼠大，乳導管明顯，采用自制通乳針在眼睛直視的情況下就可以將針頭置入乳腺管，注入菌液。該方法操作簡便，不需要切除部分乳頭，可操作性強。試驗發現，外周血中的嗜中性粒細胞在注菌后6 h 和12 h 升高，與注菌0 h 差異極顯著，之后差異不顯著。說明注菌后，可快速激發機體免疫防御體系，參與乳腺局部的免疫反應。同時在組織學的動態觀察中也發現，在6 h、12 h 和24 h，乳腺腺泡內PMNs 逐漸增多，之后出現腺泡損傷，結構不清，萎縮等組織學變化。鐘凱等采用內毒素誘發大鼠乳腺炎試驗中，發現不同劑量的內毒素均可引起嗜中性粒細胞在乳腺中的浸潤和游出，并隨劑量的升高，腺泡的破壞程度加重[7]。楊明峰等[9]在用金黃色葡萄球菌誘導小鼠乳腺炎中，發現乳腺上皮腫脹、脫落，大量淋巴細胞浸潤。而本研究中采用大鼠作為動物模型，觀察到接種后，隨著時間的推移，乳腺腺泡和基質中有大量的PMNs浸潤，即嗜中性粒細胞浸潤為主，這與臨床奶牛乳腺炎的發病相似。

在對乳腺組織細菌載量的檢測中發現，注菌后6 h，組織中細菌含量急劇升高，之后開始下降，但在96 h 時依然可以分離到金黃色葡萄球菌，高于300 CFU/mg 乳腺組織。說明注菌后，雖然外周血的炎癥反應在12 h 后恢復正常，組織學中炎性細胞減少，但金黃色葡萄球菌依然存在，而且細菌的含量高于有關學者在小鼠乳腺中檢測到細菌量100 CFU/mg 乳腺組織[5]，說明在大鼠乳腺接種金黃色葡萄球菌后，乳腺中細菌載量雖然減少，但可持續性存在，引發該疾病的傳播，與臨床金黃色葡萄球菌感染進程相似。

胸腺是中樞免疫系統，脾臟是淋巴細胞居留和增殖以及產生特異性免疫的器官。脾臟腫大是感染后T 淋巴細胞和B淋巴細胞增殖的表現，因此胸腺脾臟指數間接反映了機體對各種刺激的免疫反應[10]。試驗中發現，胸腺指數和脾臟指數在接種后，直至96 h，均出現顯著或極顯著升高。說明接種后，胸腺和脾臟均發生了不同程度的增殖，增加了淋巴細胞的活化，但也可能與其提高機體抗氧化活性，減輕自由基損傷有關[7、11]。

綜上所述，該研究建立了金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺的動物模型，動態觀察了不同時間點乳腺病理組織學和細菌載量的變化，證實該模型可建立與奶牛金黃色葡萄球菌乳腺感染類似的病理過程。因此，可利用該模型研究細菌與乳腺相互作用，藥物和疫苗研制等，具有很好的應用價值。

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