人臍帶間充質干細胞的分離、培養及鑒定

韓 華，薛 改，張俊勤，閆 萍，李艷麗

（1.河北省人民醫院婦產科，河北石家莊050051；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院藥劑科，河北石家莊050082；3.中國人民解放軍第二六○醫院病理科，河北石家莊050041）

人臍帶間充質干細胞的分離、培養及鑒定

韓 華1，薛 改2，張俊勤1，閆 萍1，李艷麗3

（1.河北省人民醫院婦產科，河北石家莊050051；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院藥劑科，河北石家莊050082；3.中國人民解放軍第二六○醫院病理科，河北石家莊050041）

目的 探討人臍帶華通膠間充質干細胞體外分離、培養、鑒定及凍存、復蘇的方法。方法 收集健康足月新生兒臍帶組織，采用組織塊貼壁法分離、培養臍帶間充質干細胞，流式細胞儀檢測細胞表面抗原，將細胞凍存3個月后復蘇，鑒定復蘇后細胞的特性。結果 組織塊貼壁法獲得臍帶間充質干細胞成功率高；細胞表面高表達CD29、CD44、CD90和CD105，不表達造血干細胞表型CD34、CD45等；凍存后再復蘇細胞活性高達80%～90%。結論 組織塊貼壁法可以從人臍帶華通膠中較好的分離、培養出間充質干細胞，為干細胞移植實驗研究和臨床治療提供了理想的細胞來源。

臍帶；間充質干細胞；胎血

干細胞是一群具有自我更新和分化潛能的細胞，根據發育狀態可以分為胚胎干細胞和成體干細胞。其中間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，在體外可以分化誘導為骨、脂肪、神經等多種組織細胞［1－3］，具有向受損組織歸巢并且修復、重建受損或病變組織器官的特點。此外，MSCs還具備免疫原性低、移植成活率高、細胞治療效果好等特點，因此成為當前干細胞研究的熱點。目前臨床應用MSCs的主要來源為骨髓、臍帶血［4］，但成人骨髓中MSCs數量較少，病毒感染率高，免疫原性強，且取材較復雜，限制其應用［5］。從臍帶血中獲取MSCs成功率較低，分離數量較少，易受干擾，影響了其臨床應用。近年研究顯示，人臍帶中存在大量的MSCs，與其他來源相比，臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesencymal stem cells，UC-MSCs）更加易于獲得，對母子均無損傷，且凍存和復蘇后細胞的生物學性狀無明顯變化［6］，使其成為細胞治療中的理想細胞而逐漸替代骨髓來源MSCs。本實驗主要研究人UC-MSCs的分離、培養、鑒定，以及細胞的凍存、復蘇，旨在為下一步進行細胞移植治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍帶標本 取自河北省人民醫院婦產科，均為正常足月剖宮產新生兒臍帶，共10根，排除母兒各種傳染性疾病及家族遺傳病，獲得產婦及家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM／F12培養液、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、胰蛋白酶／EDTA消化液、CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC、人白細胞DR抗原-FITC、超凈工作臺、OLYMPUS倒置顯微鏡、流式細胞儀、培養箱、離心機、無菌培養瓶等。

1.2 實驗方法

1.2.1 UC-MSCs的提取及培養 無菌取剖宮產新鮮臍帶約10 cm，生理鹽水洗去臍帶殘留血液，剪成2～3 cm的小段，再次漂洗，縱行剖開臍帶，剔除1條臍靜脈、兩條臍動脈，剝離華通膠。用眼科剪將華通膠剪碎成1 mm3的小組織塊，轉移至細胞培養瓶中，加入含有體積分數為10%FBS、100 U／m L青霉素、100 mg／L鏈霉素的DMEM／F12培養液，于5% CO2、37℃的培養箱中靜置培養。倒置顯微鏡每天觀察細胞生長情況。1周后首次換液，此后3～4 d換液1次。待細胞長至80%～90%融合時用胰蛋白酶／EDTA消化液消化傳代，顯微鏡下控制消化時間。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞表面標志物 分別取原代、第3代、第6代、第9代細胞，達到80%～90%融合時用胰蛋白酶／EDTA消化液消化，制成1× 106／m L細胞懸液。分別加入鼠抗人單克隆抗體CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC各10μL，充分混勻，室溫下反應30 min，每管加入1.5 m L PBS，1 200 r／min離心5 min，棄上清，每管加入100μL PBS，流式細胞儀檢測。

1.2.3 UC-MSCs的凍存及復蘇 收集第三代剛融合的UC-MSCs，胰酶消化細胞，離心5 min，離心后以FBS配制的10%二甲基亞砜重懸細胞，置入－80℃冰箱，第2天轉入液氮中保存。凍存3個月后復蘇細胞，從液氮中取出凍存管，將細胞直接放入37℃水浴箱中融化，PBS洗滌2遍，置入含10%胎牛血清的DMEM培養瓶內，放入37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞傳代至第3代時，用流式細胞儀檢測鑒定，方法同前。

2 結 果

2.1 UC-MSCs的形態學觀察 成功從臍帶組織中分離出華通膠，經培養后用倒置顯微鏡觀察。接種后1～2 d組織塊開始貼壁，7 d后可見部分細胞從組織塊周圍爬出，形態呈梭形、紡錘形，局部可成集落生長，14 d左右細胞形成片狀融合達80%，呈旋渦狀生長，即可進行1∶3傳代。傳代后細胞生長能力明顯增強，細胞呈現均一的長梭形，類似成纖維細胞，成典型的旋渦狀排列生長。細胞在增殖傳代過程中形態無明顯變化。

2.2 UC-MSCs的表面標志物測定 流式細胞儀檢測UC-MSCs免疫表型，結果顯示，原代培養的UCMSCs已經開始高表達CD44、CD90、CD105，但仍表達一定程度的CD34、CD45，而第3代UC-MSCs高度表達CD29、CD44、CD90、CD105等間充質細胞標志，幾乎不表達CD34、CD45等造血細胞、內皮細胞標志和主要組織相容性抗原人白細胞DR抗原。2.3 UC-MSCs的凍存、復蘇 凍存3個月后再復蘇，鏡下可見細胞飽滿，邊緣整齊，形態完整，細胞活力為80%～90%，傳代生長良好，與凍存前基本一致。復蘇后的細胞傳至第3代時，經流式細胞儀檢測，其表面標志物測定結果與未凍存的UC-MSCs相似。

3 討 論

目前，干細胞的研究逐漸成為現階段的熱點。MSCs是來源于中胚層間充質的成體干細胞，主要存在于骨髓、臍血、臍帶、外周血等組織中，最早從骨髓中分離得到。但骨髓MSCs取材較困難，污染率高，且隨著年齡老化細胞數量和分化能力相對減少和減弱［7－8］，因而限制其臨床應用。與其相比，人臍帶組織作為“醫療廢物”，從中提取MSCs取材方便，不存在倫理問題，且細胞含量高、增殖能力強、免疫原性低，越來越受到研究者的關注。

正常臍帶是連接胎兒臍部與胎盤之間的索狀結構，表面被覆羊膜［9］，內含2條臍動脈和1條臍靜脈。在臍血管周圍有黏蛋白樣組織包裹，稱為臍帶華通膠，其富含大量的間充質干細胞、膠原纖維、透明質酸等［10］。目前，從人臍帶華通膠中分離和培養MSCs的方法主要有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法操作復雜，耗時長，技術要求高，對細胞機械損傷和化學污染較重。因而，本實驗采用組織塊貼壁法分離培養MSCs，結果顯示組織塊在培養7 d左右即有細胞爬出，細胞呈典型的紡錘形，增殖較快，14 d左右細胞呈漩渦狀生長，傳代后細胞形態以梭形纖維樣細胞為主，呈漩渦樣生長，生長能力增強。這表明MSCs可以在短時間內貼壁、快速生長，培養的細胞可穩定傳代，細胞形態與增殖能力沒有明顯改變，與國內外研究報道基本一致［11］。

既往研究［12－13］表明，MSCs尚無特異性膜表面相關抗原，但成熟MSCs能夠高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106等膜表面標記物，不表達CD14、CD34、CD45等造血干細胞標志抗原。本實驗選取了報道較多的細胞表面標記物，應用流式細胞儀進行檢測，結果顯示UC-MSCs高度表達CD29、CD44、CD90、CD105，幾乎不表達造血干細胞標志物，與骨髓來源MSCs具有相似的免疫表型，同以往研究結果一致。此外，組織相容性抗原人白細胞DR抗原的低表達可以證明UC-MSCs免疫原性弱，不會引起排斥反應，異體移植幾乎不受影響。

UC-MSCs的凍存和復蘇具有重要的臨床價值，需要嫻熟的技術和嚴格的管理，以便很好地保證經分離、凍存、復蘇后的UC-MSCs在臨床使用過程中的安全性和有效性。本研究結果顯示，在UCMSCs凍存復蘇過程中，細胞活性及生長速度沒有受到明顯影響，復蘇后的細胞形態、特性及表面標記物測定同凍存前基本一致，為建立UC-MSCs庫提供了初步的實驗依據。

綜上所述，組織塊貼壁法分離培養UC-MSCs是一種簡便易行、穩定成熟的細胞培養方法。UCMSCs以其來源豐富、取材簡單、擴增迅速、細胞數量多、免疫原性低等獨特的優點，逐漸成為組織再生醫學中最有潛力的種子細胞，給進一步進行干細胞移植實驗研究和臨床治療帶來了廣闊的前景［14］。

［1］ Olson AL，Swigris JJ.Idiopathic pulmonary fibrosis：diagnosis and epidemiology［J］.Clin Chest Med，2012，33（1）：41－50.

［2］ Doorn J，Moll G，Le Blanc K，et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells：paracrine effects and potential improvements［J］.Tissue Eng Part B Rev，2012，18（2）：101－115.

［3］ Mueller MB，Blunk T，Appel B，et al.Insulin is essential for in vitro chondrogenesis of mesenchymal progenitor cells and influences chondrogenesis in a dose-dependent manner［J］.Int Orthop，2013，37（1）：153－158.

［4］ Lee JW，Fang X，Krasnodembskaya A，et al.Concise review：Mesenchymal stem cells for acute lung injury：role of paracrine soluble factors［J］.Stem Cells，2011，29（6）：913－919.

［5］ 陶艷玲，張顥.人臍血間充質干細胞分離、培養及向成骨細胞分化的實驗研究［J］.臨床薈萃，2008，23（23）：1695－1697.

［6］ Eggenhofer E，Steinmann JF，Renner P，et al.Mesenchymal stem cells together with mycophenolate mofetil inhibit antigen presenting cell and T cell infi ltration into allogeneic heart grafts［J］.Transplant Immunol，2011，24（3）：157－163.

［7］ Mi Z，Bhattacharya SD，Kim VM，et al.Osteopontin promotes CCL5-mesenchymal stromal cell-mediated breast cancer metastasis［J］.Carcinogenesis，2011，32（4）：477－487.

［8］ Levi B，Wan DC，Glotzbach JP，et al.CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factorβ1（TGF-β1）signaling［J］.J Biol Chem，2011，286（45）：39497－39509.

［9］ Nurden AT.Platelets，inflammation and tissue regeneration［J］.Thromb Haemost，2011，105（Suppl 1）：S13－33.

［10］ Jiang R，Xia Y，Li J，et al.High expression levels of IKKalpha and IKKbeta are necessary for the malignant properties of liver cancer［J］.Int J Cancer，2010，126（5）：1263－1274.

［11］ 雷鑫，陳彥，張建林，等.評價臍帶間充質干細胞移植前細胞活性的指標［J］.中國組織工程研究，2013，17（32）：5847－5854.

［12］ 孫建華，丁鐫.人臍帶間充質干細胞的生物學特性與研究進展［J］.臨床輸血與檢驗，2013，15（2）：190－192.

［13］ 盧潤章，趙經慧，程梅，等.人臍帶間充質干細胞體外培養的生物學特性研究［J］.黑龍江醫學，2013，37（2）：81－83.

［14］ Fan CG，Zhang QJ，Zhou JR.Therapeutic potentials of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord［J］.Stem Cell Rev，2011，7（1）：195－207.

（本文編輯：劉斯靜）

Isolation，culture and identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells

HAN Hua1，XUE Gai2，ZHANG Jun-qin1，YAN Ping1，LI Yan-li3
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Pharmacology，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuan g 050082，China；3.Department of Pathology，PLA 260 Hospital，Shijiazhuan g 050041，China）

ObjectiveTo explore isolating，culturing，identifying，freezing and thawing mesenchymal stem cells（MSCs）approach from Wharton jelly of human umbilical cord.MethodsThe MSCs were isolated from neonate umbilical cord，cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells，frozen 6 months，were thawed，then their biological characteristics were identified.ResultsMSCs were easily obtained from Wharton jelly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29，CD44，CD90 and CD105 positively，but negatively for CD34，CD45.The living cells of MSCs were 80%－90%after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.ConclusionMSCs can be successfully isolated from Wharton jelly of human umbilical cord by this method.The stem cells derived from Wharton jelly of human umbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.

umbilical cord；mesenchyma stem cells；fetal blood

R394.2

A

1007-3205（2015）01-0021-03

2014－07－22；

2014－09－20

韓華（1982－），女，河北邯鄲人，河北省人民醫院主治醫師，醫學碩士，從事婦產科疾病診治研究。

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.008