細胞治療與AIDS功能性治愈

史繼靜，張　昕，徐若男，王福生

·論著·

細胞治療與AIDS功能性治愈

史繼靜，張昕，徐若男，王福生

HIV可與被感染細胞的基因組整合形成潛伏感染，進而構成機體的病毒儲存庫，后者是聯合抗反轉錄病毒療法無法徹底清除病毒、治愈AIDS的根源，探索有效的策略來實現AIDS的功能性治愈是目前AIDS研究的熱點。“柏林病人”重新定義了HIV感染治療的結局，燃起了人類治愈AIDS的希望和信心。目前，以干細胞、T細胞等為主的細胞治療策略被認為是治愈HIV感染的主要策略之一。本文就近年來細胞治療在AIDS功能性治愈中的研究進行概述。

獲得性免疫缺陷綜合征；HIV；治療結果

自1981年首次從美國同性戀患者體內發現HIV以來，據WHO統計，截至2014年全世界HIV感染者已超過3500萬［1］，嚴重威脅人類身體健康。聯合抗反轉錄病毒療法（combination antiretroviral therapy，cART）的問世帶來AIDS治療史上的革命性進展，但由于患者體內病毒儲存庫持續存在，導致cART無法徹底治愈HIV感染，尋求有效策略徹底清除病毒成為亟待解決的問題?！鞍亓植∪恕钡某霈F給人類攻克AIDS燃起希望和曙光［2-3］，免疫策略尤其是以干細胞為主的細胞療法成為研究熱點和重點之一。本文就HIV潛伏持續存在的機制及細胞治療在實現AIDS功能性治愈中的作用討論如下。

1　HIV儲存庫與功能性治愈

1.1HIV潛伏感染的形成HIV與宿主基因組整合后可中止轉錄、翻譯等生命過程，與靶細胞共同維持靜息狀態形成潛伏感染，進而在機體內構成穩定的前病毒儲存庫，成為AIDS無法徹底治愈的根源，一旦宿主細胞被活化或cART中斷即可產生具有感染力的病毒，導致停藥后幾乎全部復發。早在1995年，首次證實HIV感染者體內存在潛伏感染形成的HIV儲存庫，進一步分析發現其在急性感染早期大概感染后幾天內即可形成，在接受cART的患者體內亦可持續存在［4-5］，隨后其特點及形成機制被逐步揭示。

Chomont等［6］發現大部分的病毒儲存庫存在于中樞記憶性和過渡記憶性CD4+T淋巴細胞，且二者相對比例與患者體內CD4+T淋巴細胞計數有關。記憶性CD4+T淋巴細胞較長的半衰期決定了HIV儲存庫的長期存在，理論上需要73年才能徹底清除［4］。隨后發現純真CD4+T淋巴細胞、Tfh細胞、巨噬細胞、造血干細胞、樹突狀細胞、胸腺細胞、星形膠質細胞等亦是HIV潛伏感染的靶細胞［6-8］。同時，在中樞神經系統、腸道相關淋巴組織等藥物赦免位置或藥物代謝尚不明確部位亦潛存病毒。新近發現B細胞濾泡可作為猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）的庇護所，允許SIV感染猴子精英控制者體內病毒持續產生［9］。

對HIV潛伏感染形成機制進行研究發現，其在分子水平上主要受病毒cDNA整合位點、宿主細胞轉錄因子的可用性、病毒基因表達的表觀遺傳調控以及HIV-1轉錄狀態對細胞核拓撲結構的依賴等因素影響［10］。同時，從免疫學機制上分析，機體HIV特異性免疫無法識別和清除被感染細胞亦是導致HIV潛伏庫持續存在的重要因素［8］。

1.2AIDS功能性治愈目前，AIDS的治愈標準分為徹底治愈和功能性治愈。前者指從體內徹底清除病毒；后者與前者不同，體內病毒并未完全清除，但在停用cART后，體內病毒仍控制在檢測限以下，且CD4+T淋巴細胞的數量和功能維持正常，臨床無免疫缺陷和疾病進展的表現。由于HIV儲存庫的存在以及病毒的高變異性，實現AIDS徹底治愈困難重重，功能性治愈被認為是最有可能達到的目標［11］。

繼2011年Dieffenbach和Fauci［12］提出HIV功能性治愈的概念后，Lampton［13］在2013年首次報道1例功能性治愈嬰兒，即“密西西比嬰兒”。不幸的是，2014年7月，美國專家宣布時隔12個月后在該患兒體內再次檢測出病毒，說明病毒庫在體內伴隨感染之時便已建立。該患兒的治療雖然最終未能達到功能性治愈，但仍為嬰幼兒患者可能通過早期高效抗反轉錄病毒療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）控制病毒的進一步復制及病毒儲存庫的建立，而達到AIDS功能性治愈提供了思路。

除著名的“柏林病人”外，目前在二類患者身上實現了功能性治愈。一類是僅占HIV感染者1%的精英控制者，此類患者體內依然存在具有復制能力的病毒和較低水平的病毒潛伏庫，但在不進行HAART的情況下，機體可自發有效地控制病毒至檢測限以下。對其機制進行分析發現，與此類患者具有保護性的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因如HILA-B*27、B*57和B*5801有關，這些等位基因被認為可呈遞保守的免疫顯性表位，激發較強的HIV特異性CD8+T淋巴細胞反應，從而有效控制體內潛伏病毒［14］。另一類是急性感染早期即開始HAART的患者，此類患者不具備精英控制者的HLA保護性等位基因，體內亦缺乏較強的HIV特異性細胞毒性T淋巴細胞應答，但在中斷治療數年后病毒仍可較好地被控制在檢測限以下。進一步隨訪分析發現，與大多數慢性感染階段才開始抗病毒治療的患者相比，此類患者中斷治療后體內長期存活的靜息CD4+T淋巴細胞在總的病毒儲存庫中僅占較小比例，表明早期抗病毒治療可顯著降低長期存活記憶細胞中病毒儲存庫的形成［15］。同時，亦有學者報道HAART在感染早期啟動后，一旦中斷，多數患者將出現病毒反彈［16］。因此，須進一步優化抗HIV感染的治療方案，尋找最佳的治療時機和策略來實現AIDS功能性治愈。

2　細胞治療在實現AIDS功能性治愈中的探索

實現AIDS功能性治愈不僅須要抑制血漿病毒復制，同時須要最大限度地減少病毒庫，并控制潛伏或殘留病毒的復制，避免停藥后復發。目前的HAART藥物雖然能使患者血漿中的病毒載量大幅度下降，甚至達到檢測不出的水平，但是藥物對潛伏的病毒，尤其是潛伏在靜止淋巴細胞內的病毒無能為力，不能從宿主細胞中移走病毒的遺傳物質；一旦停藥，潛伏病毒會在體內重新繁殖，導致疾病再燃，因而無法徹底治愈［17］。

近年來，隨著AIDS功能性治愈研究的增多和深入，出現很多有前景的方法，部分已進入臨床試驗階段。因罹患白血病接受2次造血干細胞移植（植入的干細胞攜帶對HIV入侵具有抵抗力的CCR5突變的純合子基因——CCR5Δ32/Δ32）而實現AIDS治愈的“柏林病人”的出現，使細胞治療在控制病毒復制中的作用受到密切關注，并開展了廣泛探索。

2.1未進行基因修飾的免疫細胞治療著名的“波士頓病人”因發生惡性淋巴瘤而進行造血干細胞移植，與“柏林病人”不同，植入的干細胞是CCR5野生型，對HIV入侵不具有抵抗力，移植后停止HAART曾一度檢測不到病毒，提示造血干細胞移植過程中發生的嵌合效應或移植物抗宿主反應在HIV清除中起重要作用，但數月后病毒反彈而不得不繼續抗病毒治療。這2例“波士頓病人”未實現功能性治愈，但像“柏林病人”一樣，鼓舞了科學家利用干細胞手段治愈HIV感染的信心［18］。隨后，另有2例并發惡性腫瘤的HIV感染者植入攜帶CCR5Δ32/Δ32的成人干細胞，但于4個月后因感染而死亡［19］。

“柏林病人”治愈的關鍵在于植入了攜帶對HIV感染具有抵抗力的純合子基因CCR5Δ32/Δ32的供體造血干細胞，但是攜帶該類基因的個體很少，在北歐人群中僅占0.8%～1.0%，其他種族更少［1］。同時造血干細胞移植需要嚴格的HLA配型，大部分HIV感染者不可能重現“柏林病人”的成功，因此有學者報道采用CCR5Δ32/Δ32的臍血干細胞移植治療HIV感染，并有望成為目前治療HIV感染最可行的方法［20］。Duarte等［21］采用CCR5Δ32/Δ32臍血干細胞移植治療1例并發B細胞淋巴瘤的HIV感染者，先后進行2次移植。第1次移植后第7周嵌合率＜5%，第52天又進行第2次移植并取得成功，第73天檢測嵌合率為100%，至此患者的造血細胞包括T淋巴細胞均轉變為CCR5Δ32/Δ32突變型。對其血漿病毒載量檢測發現移植后快速下降，到完全嵌合時達到最低，且檢測不到HIV DNA。遺憾的是，移植后3個月患者因淋巴瘤病情惡化而死亡。

除造血干細胞和臍血干細胞外，臍帶間充質干細胞亦被用于HIV感染的治療。王福生團隊用人臍帶間充質干細胞治療經HAART免疫重建失敗的HIV感染者，發現該方法可顯著增加患者CD4+T淋巴細胞數量，降低免疫系統超活化，為用于細胞治療的細胞種類的選擇提供了一種參考［22］。

2.2基因修飾的免疫細胞治療鑒于CCR5Δ32/ Δ32突變體的稀缺，通過基因改造技術制造CCR5表達缺陷的免疫細胞（通常為干細胞和T細胞），從而使HIV無法侵入免疫系統，重現“柏林病人”的成功，成為AIDS功能性治愈研究的熱點。自20世紀90年代晚期開始，已有不少科學家進行基因修飾細胞用于HIV感染治療安全性、可行性和有效性的探索?？笻IV的核酸酶、反義轉錄、RNA誘餌等技術被廣泛應用。

Tebas等［23］在體外運用鋅指核酸酶技術敲除患者CD4+T淋巴細胞的CCR5基因，擴增培養后回輸患者體內，經Ⅰ期臨床試驗證實是安全可行的。在經Ⅰ期臨床試驗證實轉導OZI（一種反轉錄載體，攜帶抗病毒RNA編碼蛋白Tat和Vpr的核酸酶基因）的T細胞和CD34+造血干細胞回輸療法安全和有效的基礎上，美國加州大學洛杉磯分校完成了第1個隨機、雙盲、安慰劑對照的干細胞基因療法Ⅱ期臨床試驗，共入組74例患者。動員患者的CD34+造血前體細胞（hematopoietic progenitor and stem cells，HPSCs）轉導OZI后重新輸入患者體內?；剌敽?7～48周2組患者血漿病毒載量無明顯差異，40～100周治療組病毒載量明顯下降，且至100周時體內CD4+T淋巴細胞數量較對照組顯著增加。這一研究首次證實了經基因修飾的HPSCs輸入患者體內的安全性和有效性［24］。Wolstein等［25］利用慢病毒載體LVsh5/c46（同時編碼下調CCR5表達的發夾RNA 和HIV融合抑制劑c46）轉導CD34+HPSCs和T細胞，進行了臨床前安全性和有效性實驗，目前正在進行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT01734850），同時這也是第1個用RNAi聯合C46抑制劑進行免疫細胞基因修飾治療HIV感染的臨床試驗。

嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）是當前過繼性細胞治療技術中的最新技術之一，實現了從基礎免疫學機制研究到臨床免疫治療應用的轉變。早在20年前科學家們已嘗試將CAR-T用于HIV感染治療中，Scholler等［26］對1998—2005年3項臨床試驗（Mitsuyasu、Deeks和Aronson試驗）的患者隨訪發現，表達CD4ζ CAR的自體CD4+和CD8+T淋巴細胞在HIV感染者體內可穩定存活至少11年，顯示出CAR-T在HIV感染細胞治療領域的強大潛力。HIV Env特異性地表達CD4-CD3ζ嵌合受體的T細胞在體外試驗中可有效殺死HIV感染細胞或表達HIV Env蛋白的細胞，但這種第1代CAR-T在隨后的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中并未獲得成功。Sahu等［27］設計出的第2代CAR-T（命名為CD4-CD28-CD3ζ）不僅可殺死表達HIV Env蛋白的細胞，且在細胞系模型上證實可以激活潛存的HIV并將其清除，為尋求有效策略實現AIDS功能性治愈甚至徹底治愈提供了參考。造血干細胞具有分化為多種免疫細胞的能力，因此與CD4+T淋巴細胞相比，基因修飾的造血干細胞可以長期提供抵抗病毒感染的免疫細胞亞群，幾乎涵蓋了已知的所有能被HIV感染的靶細胞［28］。但現有的臨床試驗證實2種細胞均未獲得理想療效，體外靶基因較低的轉導效率和轉導導致較多異源基因進入靶細胞，以及植入后可檢測到的修飾細胞含量極低等可能是限制其療效的重要因素。因此，如何克服上述障礙，延長修飾細胞在體內的存活時間和提高植入率是提高療效的關鍵。Ye等［29］采用TALENs或RNA引導的CRISPR-Cas9核酸酶技術與piggyBac技術聯合，設計出攜帶無殘存序列的CCR5Δ32突變體的多能干細胞，轉導效率優于目前常用的干細胞基因改造技術，并在體外將其誘導分化為抗HIV感染的單核細胞和巨噬細胞。

Myburgh等［30］利用RNAi技術，將敲除CCR5的慢病毒載體轉導HPSCs后植入人源化小鼠模型，移植后小鼠對CCR5-HIV病毒株有持久抵抗力，且數月后病毒載量明顯降低，人源化CD4+T淋巴細胞持續存在。表明這種基于HPSCs的CCR5敲除策略有望在體內有效控制HIV，且人源化CD4+T淋巴細胞的持續存在克服了以往只有較少比例抗HIV細胞存在的局限性，有望持久提供抗HIV的免疫活性細胞。

病毒基因偏嗜性的改變對細胞治療療效亦有較大影響。Kordelas等［31］報道1例體內可檢測出CXCR4-HIV RNA的患者進行了CCR5Δ32/Δ32突變型造血干細胞移植，在清髓治療開始時停用抗病毒藥物，但移植后3周因病毒反彈而繼續cART，移植后12個月因非霍奇金淋巴瘤而死亡。對其基因型進行分析發現移植前以CCR5-HIV為主，移植后轉變為以CXCR4為主，但并不清楚這種共受體轉變在抗病毒治療前后何時發生。這個病例的出現預示病毒偏嗜性變異可能成為利用CCR5敲除策略控制HIV感染的重要影響因素，因此AIDS的治愈需要多途徑、多策略的有效聯合。

3　小結與展望

過去30多年，人類對抗AIDS的戰役經歷了3次革命性進展。1996年cART的問世，無疑是第1次革命，具有劃時代意義，幾乎從根本上改變了AIDS的疾病進展，使其由致死性疾病轉為某種程度上可控的慢性疾病。cART在高效抑制患者體內病毒復制的同時，依然存在無法徹底恢復機體免疫功能、停藥后病毒快速反彈、耐藥菌株出現、長期服藥伴隨的依從性較低、經濟負擔過重、精神壓力較大等問題。這迫使人們不得不對其進行深入研究，以尋求更佳的治療方法。長期存活的病毒儲存庫的發現成為HIV感染研究里程上的第2次革命性進展，很好解釋了cART無法徹底治愈HIV感染的原因，對今后尋求有效策略清除病毒具有重要意義。2009年“柏林病人”的出現給人類實現AIDS治愈帶來希望和曙光，迎來抗AIDS戰役的第3次革命。目前，針對HIV儲存庫的清除策略主要有早期治療、抗病毒藥物的強化治療、基因治療和免疫治療等。以干細胞基因修飾為主的細胞治療雖然未取得理想效果，但為人類攻克AIDS治愈難關提供了策略和參考。相信在不久的將來，細胞治療手段與其他策略的聯合應用能夠使更多的HIV感染者實現功能性治愈，從而在HIV感染徹底治愈的道路上實現質的突破。

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（2015-10-11收稿2015-11-14修回）

（責任編委李軍本文編輯王姝）

Cell therapy and functional cure for AIDS

SHI Ji-jing，ZHANG Xin，XU Ruo-nan，WANG Fu-sheng*Infectious Diseases Diagnosis，Treatment and Research Center，302 Military Hospital of China-Peking University Teaching Hospital，Beijing 100039，China *Corresponding author，E-mail:fswang302@163.com

HIV can integrate into the genomes of infected cells and persist in a stable latent reservoir.Viral reservoir is the obstacle to the eradication of HIV and a cure for AIDS in patients receiving combination antiretroviral therapy，so pursuing effective strategies for functional cure for AIDS is the focus of AIDS research.New treatment outcome of HIV infection--the eradication of HIV occurred in the"Berlin patient"，which brought hope and inspired the confidence to cure AIDS.Nowadays，cell therapy based on stem cells and T cells is regarded as one of the potential strategies to cure HIV infection.This article focuses on the recent findings on cell therapy in functional cure for AIDS.

acquired immunodeficiency syndrome；HIV；treatment outcome

王福生，E-mail:fswang302@163.com

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.003

100039，北京大學解放軍第三〇二醫院教學醫院感染性疾病診療與研究中心（史繼靜、王福生）；100039，解放軍第三〇二醫院感染性疾病診療與研究中心（張昕、徐若男、王福生）