中國弓形蟲分離株基因型及致病性的研究進展

付曉瑩，馮永杰，梁宏德，楊玉榮

中國弓形蟲分離株基因型及致病性的研究進展

付曉瑩，馮永杰，梁宏德，楊玉榮

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種廣泛寄生于人和恒溫動物體內的原蟲，有著復雜的生活史和致病機制。近年來關于弓形蟲種群結構的研究表明其具有遺傳多樣性和地域差異性。目前，已從全球分離到1 457個弓形蟲蟲株，確定了189個基因型(http://ToxoDB.org)，其中南美的基因型具有高度的遺傳多樣性，關于我國流行的弓形蟲蟲株基因型及致病性的研究尚十分有限。本文總結了我國弓形蟲分離蟲株的基因型及特點，以期為深入研究中國弓形蟲種群結構、流行病學及致病機制提供有力依據。

弓形蟲；基因型；致病性；PCR-限制性片段長度多態性

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種呈世界性分布的細胞內寄生原蟲，可感染包括人類在內的幾乎所有恒溫動物，引起弓形蟲病[1]。據估計，全世界約有1/3的人感染弓形蟲，其中北美的感染率約為16%～40%，而在歐洲和南美感染率高達50%～80%，中國人群弓形蟲血清抗體平均陽性率為7.9%[2]。健康人群感染弓形蟲后主要表現為無癥狀的隱性感染，但對免疫功能低下及免疫缺陷者(如惡性腫瘤、AIDS及器官移植患者)，則可引起死亡[3]。孕婦、懷孕母畜(山羊、綿羊)感染弓形蟲，可引起出生缺陷、死胎或流產。

弓形蟲屬頂復門，球蟲綱，球蟲目，肉孢子蟲科，弓形蟲屬，弓形蟲種，但弓形蟲與其它肉孢子蟲不同，肉孢子蟲大多具有嚴格的宿主選擇性，而弓形蟲宿主范圍廣泛。弓形蟲生活史發育過程需要兩個宿主，貓科動物為終末宿主，弓形蟲對中間宿主的選擇極不嚴格，無論哺乳類、鳥類、人和貓科動物都可作為中間宿主。弓形蟲對組織器官的選擇也不嚴格，除成熟的紅細胞之外，任何有核細胞都可侵犯。中間宿主可以通過三種途徑感染弓形蟲：攝入含有包囊的生的或未煮熟的肉類、食入被卵囊污染的食物或飲水、母嬰垂直傳播[4]。

1 世界弓形蟲基因型特點

剛地弓形蟲的基因型有著高度的地域差異性和遺傳多態性[5]。目前，關于如何確定弓形蟲基因型，尚無確定標準。傳統的弓形蟲基因分類有：I、II、III型以及非典型基因型。I型蟲株對遠交小鼠和免疫抑制患者有很強的致病性，而II、III型的致病性較弱[6]。目前，廣泛接受的是用ToxoDB PCR限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)方法確定弓形蟲基因型。弓形蟲非典型基因型包括12型、BrI、BrII、BrIII、Africa 1、中國1型等。Africa 1和Africa 3是出現在非洲的主要基因型[7-8]。而南美洲雖以III型和ToxoDB#7型多見，但其基因型顯示出高度的遺傳多態性，而且這些蟲株的基因序列很獨特，是由不同系構成且在種群之間顯示出很強的差異性[9]，造成免疫抑制病人嚴重弓形蟲病的蟲株大都是來自南美的非典型基因型。這些不同的基因序列表明了剛地弓形蟲在北美和歐洲大都通過無性繁殖來傳播，而在南美則多為有性結合。Su[10]在2012年對全球956株弓形蟲基因型進行了鑒定及分析，通過PCR-RFLP、微衛星分型及多重酶切電泳分析(MLEE)這三種方法鑒定出138種基因型，從而表明世界弓形蟲的種群結構包括了豐富的種系以及不同蟲株的雜交系。目前，已從1 457個弓形蟲分離株，確定189個基因型(http://ToxoDB.org)。

2 我國弓形蟲蟲株基因分型結果

中國地處于亞歐大陸東部，太平洋西岸，南北跨緯度約50°。由于大部分地區處于溫帶，氣候潮濕，因此生物多樣性較為豐富。中國居住著56個民族，部分人群有吃生肉的生活習慣，增加了弓形蟲感染的幾率[11]。我國動物源性弓形蟲遺傳特點的報道結果顯示，ToxoDB#9為中國大陸的優勢基因型[12-13]，這種基因型的蟲株在越南、斯里蘭卡、巴西、哥倫比亞等國家亦有發現[14-17]，且這種基因型不同于北美和歐洲弓形蟲蟲株。不過，有關來自中國動物的弓形蟲基因型及致病性研究報道仍很少，尤其是野生動物。從人體分離到7株弓形蟲。本文歸納了從18個省、直轄市、自治區分離的154株弓形蟲，共揭示了14個基因型，流行我國的弓形蟲蟲株具有有限的遺傳多態性(表1)。

表1 流行我國的弓形蟲蟲株基因分型結果

表1(續)

Note: H: Heart; T: Tongue; BR: Brain; F: Feces; BL: Blood; LN: Lymph nodes; LU: Lung; LV: Liver; M: Muscle.

3 中國弓形蟲蟲株基因型特點及致病性研究

3.1 中國弓形蟲蟲株基因型特點 歸納的154株蟲株中有93株是分離的活蟲蟲株鑒定出來的(表2)。在這93株分離到的人及動物源性弓形蟲中，62株(66.67%)屬于ToxoDB#9型譜系，基因型ToxoDB#9在SAG2，GRA6，L358，PK1，c22-8 位點為 II 型圖譜，在c29-2，SAG3 和BTUB位點顯示為 III 型圖譜，而在Apico 位點則為 I 型圖譜。且ToxoDB#9型大都分布在中國中部和南部地區，并且在貓、豬和弓形蟲病人中均有過報道[12-13,18]，除了人、貓、豬以外，這型蟲株還分離于野鼠中。目前國內有關野生動物感染弓形蟲的報道甚少，嚙齒類和某些小動物是弓形蟲重要的中間宿主，因為它們可能是食肉動物感染弓形蟲潛在的來源。總之，關于野生動物感染弓形蟲的研究非常重要，野生動物傳播弓形蟲的機制還不十分清楚。可以說明ToxoDB#9型是廣泛流行于中國大陸的優勢基因型。在剩下的31株弓形蟲中，12株(12.90%)屬于ToxoDB#3，這型蟲株也是從人、貓、豬中分離的，除此以外，ToxoDB #3也在青海綿羊、新疆維吾爾自治區的鳥類[19]、甘肅蘭州麻雀中鑒定得到，這說明了ToxoDB #3也是中國大陸流行的主要蟲株之一。ToxoDB #3還在哥倫比亞、斯里蘭卡、越南和美國這些國家鑒定得到，這也說明了它在亞洲、北美和南美也普遍流行。

在我國分離的弓形蟲蟲株中，強致病性的蟲株(ToxoDB#10)有2株，占2.15%，分離于人和貓。其余的91株弓形蟲都為弱毒株，貓和豬、人感染居多，且呈隱性感染。

表2 我國分離到的93株弓形蟲特點

在整合的這11個中國分離的弓形蟲基因型中，有3個基因型是首次報道，但在弓形蟲基因型數據庫上(http://ToxoDB.org)未有記錄，ToxoDB#204，ToxoDB#205，ToxoDB#225。ToxoDB#204在SAG1位點顯示為獨一無二的譜系μ-2，余下9個位點和Type II型酶切圖譜相同；ToxoDB#205在SAG3和L358位點顯示為I型圖譜，其余8個位點為II型圖譜，它可能來源于中國家養動物中I型和II型的有性結合；ToxoDB#225在SAG3位點顯示III圖譜，其余位點顯示I型圖譜。這3個基因型提示流行我國的弓形蟲蟲株之間存在著有性重組，有性重組會產生一種新的基因型而且可能改變它原有的生物學特點，如增強了對小鼠甚至人的致病性等[33]。ToxoDB#17(也被稱為Type BrIV)之前在南美報道過，但是首次從中國貓體內分離出來[22]。

3.2 中國弓形蟲株的致病性 按照傳統的弓形蟲基因型分類：Type I 型蟲株為強毒株(LD100=1 parasite)，Type II型和Type III型蟲株為弱毒株(LD100>=1000 parasites)。目前，對于來源于國內的弓形蟲株其遺傳特點和毒力之間的關系還知之甚少。王林[34]采用來自于4個省市15株ToxoDB#9型弓形蟲速殖子(1×103)腹腔感染昆明鼠，死亡率從10%-100%不等，弓形蟲TgCtwh6、TgCtsd2、TgCtsd3速殖子(1×103)感染小鼠后只出現一過性反應，這說明ToxoDB#9型不同蟲株對小鼠的致病性不同。另外，王林還觀察了TgCtwh6在小鼠體內的動態分布，結果表明血液中蟲體能持續至第35天，在此期間蟲體可傳播至體內其他組織器官以及通過胎盤傳播給發育中的胎兒，造成嚴重的弓形蟲病。不同基因型弓形蟲在小鼠體內散播的規律以及對小鼠的致病性將會為弓形蟲致病機制及毒力的研究奠定基礎，但目前關于我國弓形蟲分離株研究甚少，因此需要我們做更多的努力。

4 討 論

近年來，世界各地人和動物體內分離的弓形蟲基因型越來越多，具有豐富的遺傳多態性。已知I和II型在全球廣泛分布，為歐洲和北美、非洲的優勢基因型；而南美洲分離蟲株基因型顯示出高度的遺傳多態性。然而對于我國流行的弓形蟲蟲株基因型方面的研究尚十分欠缺，不足以查明流行我國的弓形蟲的傳播、進化規律、生物學特征及其致病特點。本文整合了我國人及動物源性弓形蟲分離蟲株的基因型鑒定結果及代表性蟲株對小鼠的毒力研究進展，以期為我國弓形蟲蟲株的種群進化、致病機制、疫苗研發及弓形蟲病的診斷提供依據。

[1]Dubey JP. Toxoplasmosis of animals and humans[M]. 2nded. Boca Raton: CRC Press, 2010: 313.

[2]Zhou P, Chen N, Zhang RL, et al. Food-borne parasitic zoonoses in China: perspective for control[J]. Trends in Parasitol, 2008, 24: 190-196. DOI: 10.1016/j.pt.2008.01.001

[3]Dubey JP, Jones JL.Toxoplasmagondiiinfection in humans and animals in the United States[J]. Int J Parasitol, 2008, 38: 1257-1278. DOI: 10.1016/j.ijpara.2008.03.007

[4]Montoya JG, Liesenfeld O. Toxoplasmosis[J]. Lancet, 2004, 363: 1965-1976. DOI: 10.1016/S0140-6736(04)16412-X

[5]Lehmann T, Marcet PL, Graham DH, et al. Globalization and the population structure ofToxoplasmagondii[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103: 11423-11428. DOI: 10.1073/pnas.0601438103

[6]Howe DK, Sibley LD.Toxoplasmagondiicomprises three clonal lineages: correlation of parasite genotype with human disease[J]. J Infect Dis, 1995, 172: 1561-1566. DOI: 10.1093/infdis/172.6.1561

[7]Velmurugan GV, Dubey JP, Su C. Genotyping studies ofToxoplasmagondiiisolates from Africa revealed that the archetypal clonal lineages predominate as in North America and Europe[J]. Vet Parasitol, 2008, 155: 314-318. DOI:10.1016/j.vetpar.2008.04.021

[8]Mercier A, Devillard S, Ngoubangoye B, et al. Additional haplogroups ofToxoplasmagondiiout of Africa: population structure and mouse-virulence of strains from Gabon[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2010, 4: e876. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000876

[9]Rajendran C, Su C, Dubey JP. Molecular genotyping ofToxoplasmagondiifrom Central and South America revealed high diversity within and between populations[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12: 359-368. DOI: 10.1016/j.meegid.2011.12.010

[10]Su C, Khan A, Zhou P, et al. Globally diverseToxoplasmagondiiisolates comprise six major clades originating from a small number of distinct ancestral lineages[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109: 5844-5849. DOI: 10.1073/pnas.1203190109

[11]Gao XJ, Zhao ZJ, He ZH, et al.Toxoplasmagondiiinfection in pregnant women in China[J]. Parasitol, 2011, 139(2): 139-147.DOI: 10.1017/S0031182011001880

[12]Zhou P, Sun XT, Yin CC, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates from pigs in southwestern China[J]. J Parasitol, 2011, 97: 1193-1195. DOI: 10.1645/GE-2851.1

[13]Zhou P, Nie H, Zhang LX, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates from pigs in China[J]. J Parasitol, 2010, 96: 1027-1029. DOI: 10.1645/GE-2465.1

[14]Dubey JP, Rajapakse RP, Wijesundera RR, et al. Prevalence ofToxoplasmagondiiin dogs from Sri Lanka and genetic characterization of the parasite isolates[J]. Vet Parasitol, 2007, 146: 341-346. DOI: 10.1016/j.vetpar.2007.03.009

[15]Dubey JP, Cortes-Vecino JA, Vargas-Duarte JJ, et al. Prevalence ofToxoplasmagondiiin dogs from Colombia, South America and genetic characterization ofT.gondiiisolates[J]. Vet Parasitol, 2007, 145: 45-50. DOI:10.1016/j.vetpar.2006.12.001

[16]Dubey JP, Huong LT, Sundar N, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates in dogs from Vietnam suggests their South American origin[J]. Vet Parasitol, 2007, 146: 347-351. DOI: 10.1016/j.vetpar.2007.03.008

[17]Dubey JP, Sundar N, Hill D, et al. High prevalence and abundant atypical genotypes ofToxoplasmagondiiisolated from lambs destined for human consumption in the USA[J]. Int J Parasitol, 2008, 38: 999-1006. DOI: 10.1016/j.ijpara.2007.11.012

[18]Chen ZW, Gao JM, Huo XX, et al. Genotyping ofToxoplasmagondiiisolates from cats in different geographic regions of China[J]. Vet Parasitol, 2011, 183(1-2): 166-170. DOI: 10.1016/j.vetpar.2011.06.013

[19]Huang SY, Cong W, Zhou P, et al. First report of genotyping ofToxoplasmagondiiisolates from wild birds in China[J]. J Parasitol, 2012, 98: 681-682. DOI: 10.1645/GE-3038.1

[20]Yang YR,Ying YQ,Verma SK, et al. Isolation and genetic characterization of viableToxoplasmagondiifrom tissues and feces of cats from the central region of China[J]. Vet Parasitol, 2015, 05: 006. DOI: 10.1016/j.vetpar

[21]Li YN, Nie XW, Peng QY, et al. Seroprevalence and genotype ofToxoplasmagondiiin pigs, dogs and cats from Guizhou province, Southwest China[J]. Parasites Vectors, 2015, 8: 214. DOI: 10.1186/s13071-015-0809-2

[22]Wang L, He LY, Meng DD, et al. Seroprevalence and genetic characterization ofToxoplasmagondiiin cancer patients in Anhui Province, Eastern China[J]. Parasites Vectors, 2015, 8: 162. DOI: 10.1186/s13071-015-0778-5

[23]Qian WF, Yan WC, Wang TQ, et al. Prevalence and genetic characterization ofToxoplasmagondiiin pet dogs in central China[J]. Korean J Parasitol, 2015, 53(1): 125-128. DOI: 10.3347/kjp.2015.53.1.125

[24]Miao Q, Huang SY, Qin SY, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiinYunnan black goats (Caprahircus) in southwest China by PCR-RFLP[J]. Parasites Vectors, 2015, 8: 57. DOI: 10.1186/s13071-015-0673-0

[25]Tian YM, Huang SY, Miao Q, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiifrom cats in Yunnan Provinces, Southwestern China[J]. Parasites Vectors, 2014, 7: 178. DOI: 10.1186/1756-3305-7-178

[26]Zhang XX, Lou ZZ, Huang SY, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiifrom Qinghai vole, Plateau pika and Tibetan ground-tit on the Qinghai-Tibet Plateau, China[J]. Parasit Vectors, 2013, 6: 291. DOI: 10.1186/1756-3305-6-291

[27]Jiang HH, Huang SY, Zhou DH, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiifrom pigs from different localities in China byPCR-RFLP[J]. Parasites Vectors, 2013, 6: 227. DOI: 10.1186/1756-3305-6-227

[28]Wang L, Chen H, Liu D, et al. Genotypes and mouse virulence ofToxoplasmagondiiisolates from animals and humans in China[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e53483. DOI: 10.1371/journal.pone.0053483

[29]Wang L, Cheng HW, Huang KQ, et al.Toxoplasmagondiiprevalence in food animals and rodents in different regions of China: isolation, genotyping and mouse pathogenicity[J]. Parasit Vectors, 2013, 6: 273. DOI: 10.1186/1756-3305-6-273

[30]Qian WF, Wang H, Su CL, et al. Isolation and characterization ofToxoplasmagondiistrains from stray cats revealed a single genotype in Beijing, China[J]. Vet Parasitol, 2012, 187: 408-413. DOI: 10.1016/j.vetpar.2012.01.026

[31]Zhou P, Zhang H, Lin RQ, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates from China[J]. Parasitol Int, 2009, 58(2): 193-195. DOI: 10.1016/j.parint.2009.01.006

[32]Dubey JP, Zhu QX, Sundar N, et al. Genetic and biologic characterization ofToxoplasmagondiiisolates of cats from China[J]. Vet Parasitol, 2007, 145: 352-356. DOI: 10.1016/j.vetpar.2006.12

[33]Taylor S, Barragan A, Su C, et al. A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogenToxoplasmagondii[J]. Science, 2006, 314(5806): 1776-1780. DOI: 10.1126/science.1133643

[34]Wang L. Genotypes and mouse virulence ofToxoplasmagondiiisolates from animals and humans in China[D]. Hefei: Anhui Medical University, 2012. (in Chinese) 王林. 流行我國的弓形蟲分離株基因分型及其毒力研究[D].安徽醫科大學,2012.

Genotypes and pathogenesis ofToxoplasmagondiiisolates in China

FU Xiao-ying,FENG Yong-jie,LIANG Hong-de,YANG Yu-rong

(EngineeringCollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

Toxoplasmagondii(T.gondii) is a protozoon which infects almost all warm-blooded animals, including humans, and it has a complex life cycle and pathogenesis. The studies aboutT.gondiipopulation structure have shown that it has a genetic diversity and regional differences, recently. Now, 189 genotypes have been identified from 1 457 isolates collected from all around the world (http://ToxoDB.org). In contrast, the isolates from humans and animals from South America are genetically diverse. There was less information about genotypes and virulence ofT.gondiiisolations from China. The present study reviewed the genotypes and their biological characteristics ofT.gondiifrom animals and humans in China and provided basis for the research aboutT.gondiipopulation structure, epidemiology and pathogenic mechanism in the further.

Toxoplasmagondii; genotype; pathogenicity; PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Yang Yu-rong, Email: yangyu7712@sina.com

國家自然科學基金(No. 30800812)

楊玉榮，Email：yangyu7712@sina.com

河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.016

R382.5

A

1002-2694(2015)07-0669-05

2015-01-12；

2015-05-25

Supported by the National Nature Science Foundation of China (No.30800812)