鈣黏附蛋白E和類賴氨酰氧化酶2在膽管癌中的表達及其相關性研究

王建華

(湖南省常德市第四人民醫院消化內科 415000)

?

·論 著·

鈣黏附蛋白E和類賴氨酰氧化酶2在膽管癌中的表達及其相關性研究

王建華

(湖南省常德市第四人民醫院消化內科 415000)

目的 探討類賴氨酰氧化酶2(LOXL2)和鈣黏附蛋白E(E-cadherin)在膽管癌中的表達，并分析兩者表達水平的相互關系。方法 應用免疫組織化學(SP)法和聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術檢測膽管癌組織中E-cadherin和LOXL2 的表達情況。結果 E-cadherin 在膽管癌組的表達明顯低于癌旁組織組和正常膽管組，差異有統計學意義(P<0.05)；LOXL2 在膽管癌組的表達明顯高于癌旁組織組和正常膽管組，差異有統計學意義(P<0.05)。E-cadherin和LOXL2 在膽管癌中的表達呈負相關。結論 E-cadherin 的表達減弱和LOXL2 的表達增高共同參與膽管癌的發生和發展。

鈣黏附蛋白E； 類賴氨酰氧化酶2； 膽管癌； 浸潤和轉移； 免疫組織化學方法； 聚合酶鏈式反應

膽管癌是發生于肝內或肝外膽管上皮的惡性腫瘤，惡性程度高。影響膽管癌患者治療和遠期生存率的主要因素是腫瘤的浸潤和轉移。本研究應用免疫組織化學(SP)法和聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術檢測膽管癌中鈣黏附蛋白E(E-cadherin)和類賴氨酰氧化酶2(LOXL2)基因的表達水平，并分析兩者的相關性，對探討膽管癌浸潤、轉移的分子機制具有重要的意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 該院2011年1月至2013年12月外科手術治療的47例膽管癌患者的癌組織標本(膽管癌組)；47例膽管癌癌旁組織標本(距癌組織≥1 cm)(癌旁組織組)。所有患者術前均未接受過放療和化療，標本均經病理檢查證實。取同期就診于該院的良性膽管疾病患者的正常膽管標本20例(正常膽管組)。

1.2 檢測方法 應用SP法和RT-PCR技術檢測E-cadherin和LOXL2在所有標本組織中的表達水平。

1.3 儀器與試劑 YAQUANG生物組織脫水機，TB-718生理組織包埋機，AS325轉輪式切片機，電子恒溫水浴箱，光學顯微鏡，旋渦振蕩器，干式恒溫器K10CD，勻漿機，低溫冷凍離心機，Real-Time檢測儀ABI-7500。SP免疫組織化學染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，LOXL2鼠抗人單克隆抗體，SYBRGreen PCR試劑盒，逆轉錄cDNA合成試劑盒。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件對數據資料進行分析。計數資料采用χ2檢驗，計量資料使用wilcoxon秩和檢驗，相關分析應用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SP法檢測3組患者E-cadherin和LOXL2的結果比較 見圖1和表1。

2.2 RT-PCR檢測3組患者E-cadherin和LOXL2 結果比較 見圖2和表2。

表1 3組患者E-cadherin和LOXL2表達水平結果比較[n(%)]

注：A、B、C分別為膽管癌、癌旁組織、正常膽管中E-cadherin蛋白的表達；D、E、F分別為膽管癌、癌旁組織、正常膽管中LOXL2蛋白的表達。

圖1 3組患者E-cadherin和LOXL2蛋白的表達

2.3 膽管癌組織中E-cadherin 和LOXL2 表達的相關性 膽管癌組織中E-cadherin 和LOXL2 表達呈負相關。見表3。

表3 膽管癌中E-cadherin和LOXL2蛋白表達的相互關系(n)

注：A、C、E分別為膽管癌組中β-actin mRNA、E-cadherin mRNA、LOXL2 mRNA熒光定量擴增曲線；B、D、F分別為膽管癌組織中β-actin mRNA、E-cadherin mRNA、LOXL2 mRNA熒光定量融解曲線。

圖2 3組患者E-cadherin和LOXL2 mRNA的表達

3 討 論

腫瘤的浸潤和轉移是多基因參與、多步驟完成的復雜過程，其中腫瘤細胞黏附、運動能力的改變，與細胞外基質間的相互作用是腫瘤發生浸潤、轉移的基礎，也是其關鍵環節[1]。

3.1 E-cadherin在膽管癌中的表達及其與臨床參數的關系 Chen等[2]用實驗證實了E-cadherin可以限制L細胞侵襲。Peina-Slaus等[3]應用SP法檢測了60例人腦膜瘤中E-cadherin的表達，發現70%的腦膜瘤樣本中E-cadherin表達下調，提示E-cadherin的不穩定性在腦膜瘤的發生、發展中起著重要作用。Zhang 等[4]應用Western印跡和RT-PCR技術檢測了膽管癌細胞株QBC939和FRH 0201，結果表明snail的激活和E-cadherin的抑制可能依賴人核轉錄因子(NF-κB)的激活，NF-κB促進snail上調，從而抑制E-cadherin表達，最終促進膽管癌的浸潤、轉移。本研究采用RT-PCR技術檢測結果顯示，E-cadherin 的表達在膽管癌組、癌旁組織組、正常膽管組中差異有統計學意義(P<0.05)。本組結果表明，膽管癌患者E-cadherin 表達減弱，與相關報道一致。E-cadherin的表達減弱與膽管癌的浸潤、轉移密切相關，其機制可能是E-cadherin減少或缺失，導致細胞間的黏附減弱，原有的細胞外基質降解、形成新的細胞-基質黏附，細胞運動能力增強，從而促進腫瘤的浸潤、轉移。

3.2 LOXL2在膽管癌中的表達及其與臨床參數的關系 Peinado等[5]研究報道LOXL2的高表達與腫瘤的浸潤、轉移呈正相關，甚至在MDCK上皮細胞系中LOXL2過度表達可誘導完整的上皮間質轉變(EMT)過程，伴隨著上皮標志物的丟失和間質標志物的表達增加。Li等[6]研究發現，CC細胞株QBC939中HCVc可誘導EMT，其可能的機制是通過LOXL2的途徑。Peng等[7]對胃癌組織表達相關分析顯示，LOXL2通過Src/FAK通路而不是snail/E-cadherin通路促進侵襲。本研究應用RT-PCR技術檢測LOXL2 的表達在膽管癌組、癌旁組織組、正常膽管組中差異有統計學意義(P<0.05)，提示膽管癌患者LOXL2 的表達增強，與其他研究一致。LOXL2的表達增強與膽管癌的浸潤、轉移相關，其機制可能是LOXL2的表達增強，通過缺氧調節作用，參與上皮間質轉化，促進ECM重構等作用導致腫瘤的浸潤、轉移。

3.3 E-cadherin和LOXL2在膽管癌浸潤轉移中的相互關系 本研究在膽管癌組織中對E-cadherin和LOXL2的表達進行相關性實驗，發現兩者呈負相關關系(r=-0.464，P=0.001)。Peinado等[5]研究表明，賴氨酰氧化酶基因家族的2個成員LOXL2和LOXL3與snail相互影響，相互協同下調E-cadherin的表達。Schietke等[8]的研究也表明，LOXL2是HIF-1的一個直接靶基因，賴氨酰氧化酶的激活能抑制E-cadherin蛋白的表達，并且可導致缺氧從而抑制E-cadherin蛋白的表達，最終影響細胞的轉化且促進細胞的浸潤。本組實驗結果與Peinado等的研究結果一致，E-cadherin的表達減弱和LOXL2的表達增高共同參與了膽管癌浸潤、轉移的發生和發展。E-cadherin和LOXL2的相關性機制可能是LOXL2導致缺氧從而抑制E-cadherin蛋白的表達；另外，LOXL2表達增高參與snail介導的E-cadherin沉默，導致E-cadherin表達減弱或缺失，致使細胞間的黏附減弱，原有的細胞外基質降解、形成新的細胞-基質黏附，細胞運動能力增強，同時LOXL2增高可直接誘導EMT形成，從而提高膽管癌細胞向他處浸潤轉移的能力，最終促進膽管癌的浸潤、轉移。

綜上所述，本研究結果表明膽管癌組織中E-cadherin的表達減弱，LOXL2的表達增強，兩者在膽管癌浸潤、轉移中的表達呈負相關，E-cadherin表達減弱和LOXL2表達增強與膽管癌的分化程度低、腫瘤分期高、淋巴結轉移和組織器官轉移密切相關，主要機制可能是兩者相互作用導致膽管癌細胞間的黏附功能減弱或喪失，EMT形成，從而促進膽管癌細胞的浸潤、轉移。研究膽管癌中兩者的表達及其相互關系對進一步了解膽管癌浸潤轉移的機制及評估預后具有重要的臨床意義。

[1]Zheng XH,Wang SG.Advance in the study of invasion and metastasis of cholangiocarcinoma[J].Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2007,15(3):276-281.

[2]Chen WC，Obrink C.Cell-cell contacts mediated by E-cadherin restrict invasive behavior of L-cells[J].J Cell Biol,1991,114 (2):319-322.

[3]Peina-Slaus N,Nikuseva Marti T,Deak AJ,et al.Genetic and protein changes of E-cadherin in meningiomas[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,136(5):695-702.

[4]Zhang K,Zhaos J,Liu X,et al.Activation of NF-κB up-regulates snail and consequent repression of E-cadherin in cholangiocarcinoma cell invasion[J].Hepatogastroenterology,2011,58(105):1-7.

[5]Peinado H,Cruz M,Olmeda D,et al.A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progression[J].EMBO J,2010,24(11):3446-3458.

[6]Li T,Li D,Cheng L,et al.Epithelial-mesenchymal transition induced by hepatitis C virus core protein in cholangiocarcinoma[J].Ann Surg Oncol,2010,17(6):1937-1944.

[7]Peng L,Ran YL,Hu H,et al.Secreted LOXL2 is a novel therapeutic target that promotes gastric cancer metastasis via the Src/FAK pathway[J].Carcinogenesis,2012,30(24):1660-1669.

[8]Schietke R,Warnecke C,Wacker I,et al.The lysyl oxidases LOX and LOXL2 are necessary and sufficient to repress E-cadherin in hypoxia:insights into cellular transformation processes mediated by HIF-1[J].J Biol Chem,2011，285(9):6658-6669.

The effect and relationship of E-cadherin and lysyl oxidase-like 2 in the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma

WANGJian-hua

(DepartmentofGastroenterology,TheFourthPeopl'sHospitalofChangdeCity,Hunan,415000,China)

Objective To explore the expression of E-cadherin and LOXL2 in cholangiocarcinoma,and analyzed their relationship between the two factors in cholangiocarcinoma.Methods SP and RT-PCR were used to detect E-cadherin and LOXL2 in cholangiocarcinoma.Results The expression of E-cadherin was significantly lower in cholangiocar-cinoma than that in adjacent cholangiocarcinoma and normal bile duct.The expression of LOXL2 was significantly higher in cholangiocarcinoma than that in adjacent cholangiocarcinoma and normal bile duct.The expression of E-cadherin was negatively related to that of LOXL2.Conclusion Both the down-regulation of E-cadherin and the up-regulation of LOXL2 were related to the occurrence and development of cholangiocarcinoma.

E-cadherin； LOXL2； cholangiocarcinoma； invasion and metastasis； SP； RT-PCR

王建華，女，碩士，主治醫師，主要從事消化道腫瘤研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.033

A

1672-9455(2015)12-1742-03

2014-12-15

2015-02-05)