利用酶聯免疫反應鑒定梨樹S基因型

王春雷， 高季平， 趙憲坤

(揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009)

梨是典型的自交不親和性果樹，生產上通常需要配置花期一致、S基因型不同的品種作為授粉樹。目前，常見梨樹品種的S基因型大多被鑒定。但在生產和育種工作中梨樹品種S基因型鑒定仍然必不可少。比如，育種獲得的梨樹新品種及新發現的地方品種，這些品種的S基因型就需要鑒定。

薔薇科李屬果樹S基因型可以通過SFB序列或者S-RNase序列確定。但與李屬植物不同，梨屬花粉S基因至今還沒有確定。因此，梨屬植物的S基因型只能根據S-RNase序列判斷。梨屬S基因具有5個保守區域，分別是C1區、C2區、C3區、C5區以及薔薇科植物特有的RC4區，此外還有一個高變區:RHV區。根據S-RNase基因結構特點，開發出大量以PCR技術為基礎的果樹S基因型鑒定法，最常用的是PCR電泳法。但是此方法有一些弊端，例如該方法很難區分長度相似的S等位基因［1-2］，利用半自動測序儀雖然能精確確定PCR產物大小，但是這種半自動測序儀價格昂貴，不適合推廣［1-3］，圓點雜交也是利用探針檢測PCR產物，但是圓點雜交操作難度大，測試周期長［4］。

PCR-酶聯免疫分析技術開發于上世紀80年代，主要用于診斷植物病害和人類疾病［5-7］，也可以用來檢測單核苷酸多態性 。在該方法中，PCR產物的序列通過探針雜交來檢測，并通過免疫反應來檢測探針是否與PCR產物結合。本研究擬建立一種基于PCR-酶聯免疫反應鑒定梨樹S基因型的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用8個日本砂梨品種采自揚州大學園藝場，品種名和其S基因型分別為愛宕(S2S5)，愛甘水(S4S5)，二十世紀(S2S4)，豐水(S3S5)，今村秋(S1S6)，秋榮(S4smS5)，新高(S3S9)和幸水(S4S5)。這些品種包含7個等位基因和1個等位基因的突變體。采集各品種花前1～2 d的花蕾收集花柱，每20朵花的花柱存于1個1.5 ml離心管中，貯于－70℃冰箱中備用。

表1 探針和引物序列Table 1 The sequences of probes and primers

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA制備 從－70℃冰箱中取出花柱，花柱總RNA提取使用SV 96 total RNA isolation system試劑盒(Promega，USA);cDNA合成使用iScriptTMcDNA合成試劑盒(BioRad，USA)，4℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物和探針制備 本試驗所需引物和單鏈核苷酸探針序列如表1所示，該對引物正向引物經生物素(Biotin)標記，引物擴增獲得的產物大小在450 bp左右，該產物包含S-RNas e等位基因的高變區(RHV)。各S基因等位基因單鏈核苷酸探針主要是根據各S等位基因RHV區域序列設計獲得，各探針Tm值均為60℃。用于檢測PCR產物的探針，除了包含S等位基因探針序列，還包括一個6 bp的TATATT間隔序列和一個23 bp的檢測序列(5'-TACATTCGCAATTGAGGCTTCGT-3')，該檢測序列與地高辛(Digoxin)標記的檢測探針序列互補。雜交的原理如圖1所示。

1.2.3 序列雜交 各品種S等位基因DNA片段通過PCR擴增獲得。PCR反應體系為:50μl反應體系中加入20 ng cDNA，20 pmol正反向引物，1×Ex Taq緩沖液，400 μmol/L dNTPs，2.5 U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa Biomedicals，Japan)。PCR擴增40個循環，每個循環包括94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸 1 min。反應結束后，每5μl PCR產物添加100μl PBST緩沖液和50μg鏈酶親和素包裹的磁力球(Roche，Germany)，94℃孵育30 min。隨后，加入50μl變性溶液(0.5 mol/L NaOH，10 mmol/L EDTA)，使磁力球結合的PCR產物變成單鏈，PBST緩沖液沖洗2遍。再加入200μl雜交緩沖液(5×SCC 緩沖液，0.3%Tween-20，50 pmol S等位基因探針和地高辛標記的檢測探針)，50℃雜交2 h。PBST緩沖液清洗2遍，與含1%抗地高辛堿性磷酸酶(Anti-digoxigenin IgG Fab fragment conjugated with alkaline phosphatase，Roche，Germany)的 PBST緩沖液室溫孵育30 min。PBST清洗2次后，再與PNPP(Thermo，USA)在37℃反應，根據顏色變化判斷雜交結果，如果呈黃綠色，表示該S等位基因探針與PCR產物互補，即該品種包含1個該S基因型。

圖1 PCR-ELSIA梨樹S基因型鑒定法流程示意圖Fig.1 Schemes of S genotyping in pear by PCR-ELSIA method

2 結果

在本試驗中，我們一共設計了7個單鏈核苷酸探針，各探針分別與Pyrus pyrifolia S-RNase中的S1、S2、S3、S4、S5、S6和 S7等位基因特異互補。探針序號與其對應的等位基因序號相同。完成所有試驗步驟后，如果該溶液呈黃綠色，表明PCR產物與該S等位基因特異結合，即測試品種擁有此S等位基因。

試驗中，一共測試了8個品種，除品種秋榮外，每一個品種花柱RNA反轉錄獲得的cDNA擴增獲得的PCR產物都能與2個探針互補雜交結合(圖2)。其中愛宕能與探針2和探針5結合，愛甘水能與探針4和探針5結合，二十世紀能與探針2和探針4結合，豐水能與探針3和探針5結合，今村秋能與探針1和探針6結合，新高能與探針3和探針9結合，幸水能與探針4和探針5結合。雜交結果符合各品種S基因型。因為S4sm在秋榮花柱中不表達，所以秋榮PCR產物只與探針5呈陽性反應。其他無探針結合雜交，溶液則無明顯顏色反應。

圖2 PCR-ELSIA梨S基因型鑒定探針雜交后PNPP顏色反應結果Fig.2 The coloring reaction with PNPP of Sgenotype by PCRELISA after probe hybridation

3 討論

S基因型鑒定是果樹栽培中一項重要任務，它為果園授粉樹的配置提供依據。S基因型鑒定最早是通過觀察授粉后坐果率或者花粉管生長情況獲得，隨后該方法被更加快速、可靠的PCR擴增法取代。目前，最常用的方法就是通過通用引物擴增，電泳鑒定PCR產物大小的方法判斷S基因型。這種方法缺陷是不能區分大小相近的S等位基因［9-11］。為了解決這個問題，有學者提出使用半自動測序儀精確測定 PCR 產物大小［1-3，12］，該方法可以精確分辨產物1 bp大小差別，但是該方法需要使用昂貴的儀器。本研究利用等位基因特異探針鑒定PCR產物，不需要昂貴儀器，與半自動測序儀法相比更易操作。此外，Kitashiba等［4］開發出一種圓點雜交法鑒定果樹S基因型方法，但此方法過于靈敏，需要通過預備試驗，獲得每個探針最適雜交溫度，否則會產生假陽性反應。

我們曾經利用相似原理鑒定李子和櫻桃S基因型［13］。李子和櫻桃S基因型鑒定，既可以通過花粉自交不親和性因子SFB基因序列鑒定，也可以通過花柱自交不親和性因子S-RNase基因序列鑒定。本研究，我們又運用該方法鑒定梨樹S基因型。梨樹S基因型只能根據S-RNase基因序列判斷，這主要是因為梨花粉S基因至今未被鑒定。在李子、櫻桃S基因型鑒定中，因為在高變區存在500 bp以上內含子，我們根據所有等位基因序列設計1個正向通用引物和多個等位基因特異反向引物，再利用多引物PCR擴增梨品種S-RNase高變區。在多引物PCR中，存在引物之間相互影響，我們根據S-RNase基因編碼區設計了1對通用引物，利用花柱RNA反轉錄獲得cDNA作為PCR模板，擴增S-RNase基因高變區，不存在多引物干擾問題，同時回避了多數梨S-RNase基因沒有內含子序列的問題。除秋榮外，所有品種都與2個探針呈陽性反應，結果與各品種的S基因型一致，表明該方法非常可靠。品種秋榮所含S4sm-RNase基因發生突變，在花柱中不表達，因此無法檢測到其信號。

在該方法中，用于檢測S基因型的探針都包含3段序列，第1段是與各S基因型對應的等位基因互補序列，第2段是與地高辛標記的檢測探針互補的檢測序列，第3段是分隔上述兩部分的間隔序列。S-RNase等位基因探針通過與地高辛標記檢測探針雜交結合間接獲得地高辛標記。通過這種設計，避免每個探針都用地高辛標記，只需合成1個地高辛標記的檢測探針，從而大大降低試驗成本，尤其在多個探針時，更能體現出該方法的經濟性。

雖然在我們試驗中，由于材料限制只選取了8個品種，7個S基因型，但我們在設計引物和探針時，比較了數據庫中所有梨S基因型，保證各探針的特異性。在對梨品種S基因型進行鑒定時，可將已經公布的S等位基因分成多個組，以組為單位分別檢測，從而減少工作量。

［1］ SONNEVELD T，TOBUTT K R，ROBBINS T P.Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility(S)alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers［J］.Theor Appl Genet，2003，107(6):1059-1070.

［2］ VAUGHAN SP，RUSSELL K，SARGENT D J，et al.Isolation of S-locus F-box alleles in prunusavium and their application in a novel method to determine self-incompatibility genotype［J］.Theor Appl Genet，2006，112(5):856-866.

［3］ ORTEGA E，SUTHERLANDB G，DICENTA F，et al.Determination of incompatibility genotypes in almond using first and second intron consensus primers:detection of new S alleles and correction of reported S genotypes［J］.Plant Breeding，2005，124(2):188-196.

［4］ KITASHIBA H，ZHANG S，WU J，et al.S genotyping and S screening utilizing SFB gene polymorphism in Japanese plum and sweet cherry by dot-blot analysis［J］.Mol Breeding，2008，21(3):339-349.

［5］ INOUYE S，HONDO R.Microplate hybridization of amplified viral DNA segment［J］.J Clin Microbiol，1990，28(6):1469-1472.

［6］ KELLERGH，HUANGD P，SHIH JW，et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum by polymerase chain reaction amplification and microtiter sandwich hybridization［J］.JClin Microbiol，1990，28(6):1411-1416.

［7］ SYVANEN AC，BENGTSTROMM，TENHUNEN J，et al.Quantification of polymerase chain reaction products by affinity-based hybrid collection［J］.Nucleic Acids Res，1988，16(23):11327-11338.

［8］ TONOSAKI，KUDO J，KITASHIBA H，et al.Allele-specific hybridization using streptavidin-coated magnetic beads for species identification，Sgenotyping，and SNP analysis in plants［J］.Mol Breeding，2013，31(2):419-428.

［9］ ISHIMIZU T，SHINKAWA T，SAKIYAMA F，et al.Primary structural features of rosaceous S-RNases associated with gametophytic self-incompatibility［J］.Plant Mol Biol，1998，37(6):931-941.

［10］ SAPIR G，STERN RA，EISIKOWITCH D，et al.Cloning of four new Japaneseplum S-allelesand determination of the compatibility between cultivars by PCR analysis［J］.J Hortic Sci Biotech，2004，79(2):223-227.

［11］ TAMURA M，USHIJIMA K，SASSA H，et al.Identification of selfincompatibility genotypes of almond by allele-specific PCR analysis［J］.Theor Appl Genet，2000，101(3):344-349.

［12］ GUERRA ME，RODRIGO J，LOPEZ-CORRALES M，et al.SRNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum［J］.Plant Breeding，2009，128(3):304-311.

［13］ WANG CL，ZHANG Z P，TONOSAKI K，et al.Sgenotyping in Japanese plum and sweet cherry by allele-specific hybridization using streptavidin-coated magnetic beads［J］.Plant Cell Reports，2013，32(6):567-576.