雞IGF1R、IGFBP-3基因SNP位點之間互作效應分析

金崇富， 陳長寬， 楊智青， 時 凱， 陳應江

(江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇 鹽城 224002)

胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF)是人體最重要的生長因子之一。IGF家族由2個多肽類生長因子(IGF1、IGF2)、2類受體(IGF1R、IGF2R)和7種結合蛋白(IGFBP1～IGFBP7)組成，它們是動物生長軸上重要的因子，具有強烈的促生長和分化作用［1］。2類IGF受體的結構和功能差異很大，其中第1類IGF受體(IGF1R)是IGF功能的主要介導者。Moe等［2］研究了IGF1R基因編碼區單核苷酸多態性與日本鵪鶉體質量的相關性，發現不同基因型對10周齡體質量有極顯著的影響。高鳳華等［3］對東北農業大學肉雞品系的IGF1R基因進行遺傳多態性分析，發現不同基因型對5周齡體質量有顯著影響。雷明明等［4］研究發現，C17337024G/T突變位點與生長和屠體性狀顯著相關，與初生質量顯著相關。

IGFBP-3主要存在于血液中，它對IGF1和IGF2具有很高的親和力，是血液中最為豐富的IGFBP結合形式。血液中95%的IGF1和IGF2都與IGFBP-3結合，因此，IGFBP-3對于IGF作用的發揮起著重要作用［5］。另外，IGFBP-3可以增強 IGF1的效應，能促進IGF1在骨骼上的合成代謝效應。胡沈榮等［6］對西農薩能奶山羊IGFBP-3基因進行了遺傳多態性分析，發現西農薩能奶山羊IGFBP-3的Xsp-I基因座不同基因型間的第二胎產羔數有顯著差異，且初生質量也存在顯著差異(P＜0.05)。劉哲等［7］對奶牛IGFBP-3基因進行了多態性分析，分析結果表明AA型12月齡體長和體高均極顯著高于AB型。

數量性狀是由許多微效基因或稱多基因(Polygene)的聯合效應控制的，數量性狀直接影響畜牧產品的產量及經濟效益。如果僅僅從單基因入手進行分子輔助育種，往往不能達到最終的育種目標。在分析多基因調控的數量性狀時，需要同時對多個位點進行分析，這樣才能得到基因與性狀之間的真實相關性，在利用DNA標記進行輔助選擇時才可能獲得更大的遺傳進展［8］。本研究以鹽城地方草雞為研究對象，對IGF1R、IGFBP-3基因進行互作效應分析，以期能較全面地研究鹽城地方草雞生產性狀的分子遺傳機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從江蘇沿海地區農業科學研究所生態養殖基地采集210只母雞血樣，同時記錄母雞生長性狀(初生質量及4、8、12、16周齡體質量)和繁殖性狀(開產日齡、開產體質量、開產蛋質量、300日齡產蛋數)。翅靜脈采集血樣1.5 ml，肝素鈉抗凝，－20℃保存。DNA提取試劑盒(Omega blood DNA kit)法提取基因組DNA。

1.2 引物設計

根據GenBank中雞IGF1R基因(NC_006097)和IGFBP-3基因(NC_006089)序列，設計IGF1R基因第2外顯子引物IGR2-1和IGR2-2，以及IGFBP-3基因第1和2外顯子引物IBP1和IBP2(表1)。引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 The information of the primers

1.3 PCR-SSCP 分析

將3μl PCR產物加入7μl變性緩沖液中，98℃變性10 min，然后迅速冰浴5 min。將變性PCR產物點樣加入到10%聚丙烯酰胺凝膠中，140 V電壓電泳12 h。在電泳結束后，進行銀染顯色并拍照記錄結果。

1.4 IGF1R、IGFBP-3 基因綜合標記

兩基因位點間互作用以下模型進行方差分析:yijk=μ + Gi+ Gj+ Gij+ eijk，式中，yijk為性狀測定值，μ 為群體平均值，Gi、Gj為基因型效應，Gij為位點i和位點j間的互作效應，e為隨機殘差效應。

2 結果與分析

2.1 IGF1R、IGFBP-3基因 SSCP引物的 PCR擴增

采用 PCR-SSCP法分析 IGR2-1、IGR2-2和IBP1、IBP2引物擴增片段。結果顯示:IGR2-1擴增片段有3種帶型，定義為AA、AB和BB;IGR2-2擴增片段有3種帶型，定義為CC、CD和DD;IBP1擴增片段有3種帶型，定義為EE、EF和FF;IBP2擴增片段有3種帶型，定義為GG、GH和HH(圖1)。

2.2 IGF1R、IGFBP-3基因序列分析結果

測序結果表明，引物IGR2-1的PCR產物片段的BB型與AA型相比在第26 333 bp處發生了G→A突變，引物IGR2-2的PCR產物片段的DD型與CC型相比在第26 336 bp處發生了G→A突變，引物IBP1的PCR產物片段的FF型與EE型相比在第160 bp處發生了T→G突變，引物IBP2-1的PCR產物片段的HH型與GG型相比在第1 087 bp處發生了C→T突變(圖2)。

圖1 引物IGR2-1(a)、IGR2-2(b)、IBP1(c)和IBP2(d)的SSCP分析結果Fig.1 SSCP analysis of PCR product using primers IGR2-1(a)，IGR2-2(b)，IBP1(c)and IBP2(d)

圖2 雞不同基因型PCR產物片段的序列比較Fig.2 Sequence alignment of PCR product segments of different genotypes in chickens

2.3 IGF1R、IGFBP-3基因群體遺傳學分析

G26333A位點AA基因型為優勢基因型，基因型頻率為0.745;等位基因A為優勢等位基因，等位基因頻率為0.855。G26336A位點CC基因型為優勢基因型，基因型頻率為0.555;等位基因C為優勢等位基因，等位基因頻率為0.755。T160G位點FF基因型為優勢基因型，基因型頻率為0.495;等位基因F為優勢等位基因，等位基因頻率為0.703。C1087T位點GG基因型為優勢基因型，基因型頻率為0.415;等位基因G為優勢等位基因，等位基因頻率為0.615(表2)。

卡方適合性檢驗結果表明，群體除了在C1087T位點偏離Hardy-Weinberg平衡狀態外(P＜0.05)，在其余位點都處于Hardy-Weinberg平衡狀態。

表2 IGF1R、IGFBP-3基因基因型和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequency of IGF1R and IGFBP-3 genes

2.4 IGF1R基因 G26336位點和 IGFBP-3基因C1087T位點與生產性能的關聯分析

由表3可知，DD基因型個體在8周齡時體質量顯著高于CC基因型(P＜0.05)，DD基因型個體在12周齡時體質量顯著高于CC和CD基因型(P＜0.05)。由表4可知，GH基因型個體的開產日齡顯著低于HH基因型(P＜0.05)。

表3 G26336位點基因型與雞生產性能的相關性Table 3 Association of G26336 genotypes with production performance in chickens

表4 C1087T位點基因型與雞生產性能的相關性Table4 Association of C1087T genotypes with production performance in chickens

2.5 IGF1R基因和IGFBP-3基因對繁殖性狀的互作效應

IGF1R基因與IGFBP-3基因對繁殖性狀的互作效應見表 5。由表 5可知，G26333A×T160G、G26333A×C1087T、G26336A×T160G和G26336A×C1087T對開產日齡、開產體質量、開產蛋質量及300日齡產蛋數均無顯著影響(P＞0.05)。故IGF1R基因與IGFBP-3基因對鹽城地方草雞的繁殖性狀不存在互作。

表5 IGF1R基因和IGFBP-3基因對雞繁殖性狀的互作效應Table 5 Interaction effect of IGF1R and IGFBP-3 genes on reproductive traits in chickens

2.6 IGF1R基因和IGFBP-3基因對生長性狀的互作效應

IGF1R基因和IGFBP-3基因對生長性狀的互作效應見表6。由表6可見，IGF1R基因和IGFBP-3基因對鹽城地方草雞生長性狀存在一定互作，IGF1R基因G26336A位點與IGFBP-3基因C1087T位點對12周齡體質量存在互作效應。

2.7 IGF1R和IGFBP-3基因型組合對生產性狀的互作效應分析

G26336A與C1087T位點基因型組合對生長性狀的互作效應見表7。G26336A和C1087T位點共檢測到9種基因型組合。由于DD/HH個體數較少(1只)，不參與多重比較。CC/GG和CC/HH基因型組合個體的開產日齡極顯著高于CD/GH(P＜0.01)，CC/GH基因型組合個體的初生質量顯著高于CD/GG(P＜0.05)，DD/GG基因型組合個體的8周齡體質量顯著高于CC/HH(P＜0.05)，DD/GG基因型組合個體的12周齡體質量極顯著高于CC/GG、CC/GH、CC/HH、CD/GG、CD/GH 和CD/HH(P ＜0.01)。

表6 IGF1R基因和IGFBP-3基因對雞生長性狀的互作效應Table 6 Interaction effect of IGF1R and IGFBP-3 genes on growth traits in chickens

表7 IGF1R基因G26336A位點和IGFBP-3基因C1087T位點不同基因型組合與雞生長性狀的相關性Table 7 The relationship between different genotype combinations of IGF1R and IGFBP-3 genes and growth traits in chickens

基因型組合后括號內數值表示該基因型組合雞的只數。同列中不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(P＜0.01)和差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

在IGF1R基因G26336A位點上，DD基因型個體的8周齡體質量顯著高于CC基因型個體(P＜0.05)，12周齡體質量顯著高于CC和CD基因型個體(P＜0.05);從4、8、12周齡體質量看，具有DD＞CD＞CC的趨勢;等位基因D是體質量性狀的增效基因，等位基因C是體質量性狀的減效基因。在IGFBP-3基因C1087T位點上，GH基因型個體的開產日齡顯著低于HH基因型(P＜0.05)。

培育具有綜合性能的優良家禽品種已成為現代家禽育種的重要目標。由于家禽許多經濟性狀是多基因控制的數量性狀，在育種中通過分子標記選擇含有多個目標基因的個體，從中再選出優良的個體，實現有利基因的聚合，使品種具有更優良的生產性能。目前，通過分子標記將多個影響家禽生產性狀的基因聚合在一起的研究報道不多。趙秀華［9］在京海黃雞群體中對IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5基因進行了三基因互作效應分析，結果顯示三基因合并效應＞兩基因合并效應＞單基因效應，而且組合基因型效應不是單個基因型效應的簡單相加，其效果要優于單個基因型的效應。李國輝等［10］以白耳雞為試驗對象，檢測GH、POU1F1和PRL基因單核苷酸多態性，分析這3個基因的單基因效應與聚合基因型效應。生產上可通過選擇影響生產性狀的2個基因的SNP，進行分子標記輔助育種，這比用單個基因進行選擇的風險小。多基因的基因型組合效應不是單基因的基因型效應的簡單相加，而是高于最好的單基因的基因型效應。這提示我們，在分析多基因調控的數量性狀時，需要同時對多個位點組成的基因型組合進行分析，這樣才能得到基因與性狀之間的真實相關性。

本研究IGF1R基因G26336A位點與IGFBP-3基因C1087T位點基因型組合中，CC/GG和CC/HH個體開產日齡最大;CC/GH個體初生質量最大;DD/GG個體8周齡體質量最大;DD/GG個體12周齡體質量最大，均值為 (1 072.60±53.15)g，極顯著地高于其他基因型組合個體。提示G26336A×C1087T基因型組合中剔除CC/GG和CC/HH型個體可減小開產日齡，選留CC/GH型個體可提高初生質量，選留DD/GG型個體可提高8周齡和12周齡體質量。

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