湖羊肌肉UCP3基因序列特征分析及其在肌肉中的表達

李隱俠， 喬 永， 張 俊， 錢 勇， 孟春花， 王慧利， 鐘 聲，曹少先， 李齊發

解偶聯蛋白質(Uncoupling protein，UCPs)是一類位于線粒體內膜的質子轉運蛋白質，參與機體的能量代謝。目前，在哺乳動物中已發現的解偶聯蛋白質基因家族成員包括 UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5，其中UCP3基因在嚙齒類動物和人類的骨骼肌、白色脂肪組織、棕色脂肪組織及心肌中均有表達，尤其是在骨骼肌中高效、專一表達，是骨骼肌線粒體內膜的重要轉運蛋白質［1-2］，可能參與脂肪代謝的調節［3］。UCP3蛋白質能夠提供非顫抖的生熱作用，是體內產熱的重要調節因子，被認為是參與骨骼肌能量代謝的重要靶蛋白質物質，并顯著影響機體能量平衡涉及的體質量(肥胖)、靜止代謝率和體脂代謝等［4］。Liu 等［5］在肥胖人群中發現，UCP3 基因多態對體質量指數有顯著影響，表明UCP3多態使肥胖者體質量有增加的危險。Rudofsky等［6］研究認為，人UCP3基因調節能量平衡，與肥胖和糖尿病有關。有研究結果表明UCP3基因可能是影響豬胴體和肉質性狀的主效基因或是與主效基因連鎖的基因標記［7］。陳哲等［8］研究發現UCP3基因第四內含子Bcc I多態位點與長白豬6～7背膘厚極顯著相關。陳翠等［9］研究發現西門塔爾牛UCP3基因的Bgl I酶切位點表現多態性，而且此位點與平均日增質量、胴體長、胴體胸深、后腿寬和背膘厚性狀顯著相關。金成吉等［10］研究發現，UCP3基因表達減少與2型糖尿病模型OLETF鼠早期肥胖有關。本研究以早期生長發育較快的湖羊為研究對象，克隆測序獲得湖羊UCP3基因編碼區序列，并對序列特征進行分析，解析UCP3基因在湖羊不同部位肌肉中的表達變化，為綿羊的育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為健康純種湖羊，選自江蘇省蘇州市東山湖羊資源保種區，初生、1、2、3、4、5 和 6 月齡的各5只，共35只羊，試驗動物由東山湖羊資源保種區統一飼料管理，營養以及管理水平保持一致。屠宰后記錄屠宰數據，采取背最長肌(第12肋骨后)、腰大肌(8～12肋骨處)、前腿肱二頭肌和后腿股二頭肌樣品，迅速置于液氮中保存，帶回后置于－70℃冰箱保存備用。

1.2 RNA提取及反轉錄

用Trizol法提取各肌肉RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度(OD260/OD280=1.8～2.0)。

用隨機引物對總RNA進行反轉錄，反應體系為25μl:2μg總 RNA，1μg隨機引物，0.4 mmol/L dNTP，20 U RNAse抑制劑，200 U MMLV反轉錄酶，5μl 5×RT buffer(250.0 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，50.0 mmol/L MgCl2，250.0 mmol/L KCl，50.0 mmol/L DTT，2.5 mmol/L亞精胺)。先加 RNA模板、dNTP和隨機引物，70℃變性5 min后立即放冰上冷卻，再加其余試劑，混勻后于41℃下放置40 min。RT產物保存于－20℃備用。

1.3 引物設計與PCR反應

從GenBank中檢索綿羊UCP3(GenBank序列號:KF015729)和GAPDH［看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GenBank序列號:AF030943)］mRNA序列，用Primer premier 5.0軟件設計引物(表1)，由上海捷瑞生物技術有限公司合成。

反應體系為20μl:1μl RT產物，1U Taq DNA聚合酶，2μl 10×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500 mmol/L KCl)，0.5 mmol/L dNTP，1.4 mmol/L MgCl2，上、下游引物各 0.5 μmol/L。反應程序為:94℃預變性5 min;94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環;最后再72℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后用凝膠成像系統照相。

1.4 PCR產物回收及克隆測序

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下割取目的片斷，用Karroten DNA凝膠回收試劑盒純化。將回收純化的目的片段與PCR 2.1載體充分混勻，在恒溫金屬浴中16℃連接過夜，將全部連接液轉化到感受態細胞，涂于含氨芐抗性的LB板37℃過夜培養。挑取單克隆菌提取質粒，PCR鑒定 為陽性克隆送美吉生物公司測序。

表1 UCP3基因的引物參數Table 1 Parameters of oligo-nucleotide primer pairs of UCP3 and GAPDH

1.5 序列分析與系統發育樹的構建

用DNAMAN6.0軟件進行序列翻譯和與其他動物的核苷酸和氨基酸序列進行比對。開放閱讀框的預測在 NCBI的 ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)中進行，利用 NCBI BLAST服務器從GenBank中挑選8個來源于不同動物的UCP3所編碼的氨基酸序列，利用 DNAStar軟件進行多序列比對分析和編輯校正，采用 MEGA5.1軟件包［11］中的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統發育樹，自舉分析(Bootstrap test)采用1 000次重復抽樣檢驗獲得置信度(BP)。

1.6 Real-time PCR

Real-time PCR反應體系為20μl:1μl RT產物，1 U Ex Taq HSDNA 聚合酶，4 μl 5 ×PCR buffer，0.30 mmol/L dNTP，3.75 mmol/L MgCl2，上游和下游引物各0.50μmol/L，1μl 20×SYBR greenⅠ。反應程序為:95℃預變性1 min;95℃ 10 s，退火10 s，72℃ 15 s，45個循環;然后再72℃延伸5 min。融解曲線分析:65～94℃，每隔0.2℃讀板1次(溫度恒定1 s后讀板);最后72℃延伸5 min。每個樣品2個重復，取平均值進行計算。

圖1 綿羊肌肉UCP3基因克隆擴增電泳圖和GAPDH、UCP3基因的RT-PCR電泳圖Fig.1 The amplification profile of UCP3 gene and RT-PCR of GAPDH and UCP3 mRNA in sheep muscle

1.7 數據分析

用SPSS11.5 For Windows軟件進行分析，其中同一肌肉部位不同月齡間的基因表達差異用Oneway ANOVA進行分析。

2 結果與分析

2.1 綿羊UCP3基因和GAPDH基因擴增結果

以湖羊肌肉總RNA為模板，用所設計的UCP3基因引物P1、P2和P3進行基因擴增，PCR產物瓊脂糖電泳圖見圖1。由圖1可以看出，UCP3基因編碼區序列片段和GAPDH基因片段在湖羊肌肉組織中均有很好的擴增。

2.2 綿羊UCP3基因編碼區序列分析

UCP3基因擴增片斷克隆于 PCR2.1載體，PCR鑒定后測序，用 DNAstar對測序結果與引物設計源序列進行同源性比較，得到UCP3基因編碼區全序列。ORF Finder在線軟件預測發現測定的序列含有湖羊UCP3基因完整的開放閱讀框，長度為936 bp，編碼311個氨基酸殘基(圖2)。通過NCBI查找其他哺乳動物的UCP3的編碼區序列，DNAMAN比對發現湖羊與牛和人的核苷酸序列同源性分別為97.25%、88.61%，氨基酸序列同源性分別為95.63%和87.54%，表明UCP3基因在物種間具有一定的保守性。

圖2 不同哺乳動物UCP3基因所編碼的氨基酸序列同源性比較Fig.2 Alignment of amino acid sequences of UCP3 gene from different mammals

2.3 哺乳動物UCP3進化與系統發育樹分析

圖3 9個物種UCP3蛋白質氨基酸序列NJ系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of UCP3 coding region from nine species by NJ method

以魚類(斑馬魚)為外類群，采用 MEGA 5.1軟件中的NJ法構建哺乳動物UCP3蛋白質的系統發育樹，結果(圖3)顯示聚類結果與經典分類學結果基本一致。湖羊與8個哺乳動物聚在一起，而外類群魚類自成一類;在哺乳動物中，鼠科自成一類，3種家畜品種和3個靈長類物種聚在一起;在3種家畜中，湖羊首先和牛聚為一類，然后再與豬聚為一類;而靈長類中的人類、黑猩猩首先聚在一起，然后再和獼猴聚為一類。

2.4 湖羊羔羊不同部位肌肉UCP3基因表達的變化

用 Real-time PCR 法對湖羊羔羊初生、1、2、3、4、5和6月齡時背最長肌、腰大肌、前腿肱二頭肌和后腿股二頭肌4個部位肌肉的UCP3基因mRNA表達量進行分析，結果(圖4)顯示，UCP3基因mRNA在湖羊羔羊肌肉不同部位中的發育變化模式基本相似，即在出生時有較低的水平，然后略有上升，隨著月齡的增加又下降。在背最長肌中，1月齡時達到最高，4月齡時下降到最低;在腰大肌中，剛出生時UCP3基因表達水平最低，3月齡時最高，然后下降;在前腿肱二頭肌中，UCP3基因表達水平2月齡時最高，3月齡時最低;在后腿股二頭肌中，UCP3基因表達水平出生時最低，2月齡時最高。另外，初生至6月齡間UCP3基因在后腿股二頭肌中的整體表達量偏低，在腰大肌中的表達水平變化較大，3月齡時UCP3基因表達水平顯著高于初生和5月齡。

圖4 湖羊羔羊不同肌肉不同月齡UCP3基因表達的變化Fig.4 Changes of UCP3 mRNA expression levels in different muscles of differently-aged Hu lamb

3 討論

UCP3作為肌肉組織線粒體內膜的重要轉運蛋白質，對維持肌肉的能量代謝與平衡具有重要的作用［12］。UCP3與肌肉組織中脂肪酸的氧化代謝緊密相關，研究結果表明UCP3在肌肉中表達量的增加能明顯增加肌肉中脂肪酸的氧化，Son等通過轉基因的方法使小鼠肌肉高表達UCP3，發現UCP3表達水平高于正常表達水平18倍的小鼠能明顯減少因飲食增加引起的肥胖，認為UCP3可能是未來治療肥胖疾病的1個有用工具 。Nakayama等研究結果表明UCP3基因55C/T位點多態性影響日本成年人的肥胖［14］。Udaqawa等研究結果表明UCP3基因與家犬體內總膽固醇水平相關［15］。人的UCP3基因位于11q13，包含6個外顯子和5個內含子［16］;豬的UCP3基因定位在9P21～P24，開放閱讀框為936 bp，編碼311個氨基酸殘基［17］。本研究獲得了湖羊UCP3基因編碼區序列，湖羊中UCP3基因編碼區長度為936 bp，編碼311個氨基酸殘基，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，在哺乳動物間是相對保守的［16］。Esterbauer等［18］研究發現人UCP3基因存在長型和短型2種剪接體，而鼠類中只有長型UCP3基因剪接體，沒有檢測到短型的UCP3，本研究在湖羊中也只發現1種剪接方式。根據UCP3蛋白質序列構建的哺乳動物系統發育樹結果顯示，聚類結果與經典的分類結果基本一致，即湖羊與8個哺乳動物聚在一起，而外類群魚類自成一類;在哺乳動物中，鼠科自成一類，3種家畜和3個靈長類物種聚在一起;在3種家畜中，湖羊首先和牛聚為一類，然后再與豬聚為一類，此分類結果與李隱俠等［19］研究結果一致。

UCP3基因在肌肉中的表達受多種因素的影響，品種、營養水平和環境溫度等都會影響其表達。Mostyn 等［20］研究了出生后0、4、7、14 和21 日齡時商品豬和梅山豬UCP3基因表達模式，發現在脂肪組織中，7日齡以前2個品種豬UCP3的表達量相似，7日齡以后梅山豬顯著高于商品豬，表明UCP3基因表達具有品種特異性。本研究發現，湖羊羔羊肌肉UCP3的表達模式在不同部位具有較明顯的差異，在背最長肌中，出生時UCP3表達量較高，然后緩慢上升后下降，到4月齡時最低，然后又有所回升;在腰大肌和后腿股二頭肌中，剛出生的羔羊UCP3表達量較低，隨月齡的增加上升，腰大肌在3月齡時升到最高，股二頭肌在5月齡時升到最高;在前腿肱二頭肌中，出生時較高，1月齡時下降，到2月齡時升到最高，3月齡時又降到最低，4月齡時又上升，表現出波動變化的特征，表明UCP3基因在湖羊肌肉中表達的變化呈明顯的組織特異性，與前人的研究結果一致［20-21］。UCP3基因在腰大肌中3月齡時的基因表達水平顯著高于0月齡和5月齡，表明UCP3基因可能參與脂肪代謝的調節［3］。

以上研究結果表明，湖羊UCP3基因編碼區長度為936 bp，編碼311個氨基酸殘基，在哺乳動物間相對保守;根據UCP3蛋白質序列構建的哺乳動物進化樹結果與經典的拓撲結構一致;UCP3基因在湖羊肌肉中的mRNA的表達變化具有明顯的組織特異性。

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