286株銅綠假單胞菌耐藥譜及其Ⅰ類整合子的相關性研究*

陳 富，李岳軍，周 強，廖煥蘭，許振杰，陳中華

(廣東省中醫院檢驗科，廣州 510120)

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·論 著·

286株銅綠假單胞菌耐藥譜及其Ⅰ類整合子的相關性研究*

陳 富，李岳軍，周 強△，廖煥蘭，許振杰，陳中華

(廣東省中醫院檢驗科，廣州 510120)

目的 通過分析2013年分離的286株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥情況,明確Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌多重耐藥中所起的作用。方法 采用紙片擴散法進行藥物敏感試驗，并以聚合酶鏈反應(PCR)進行Ⅰ類整合子的檢測，用χ2檢驗對Ⅰ類整合子攜帶率與銅綠假單胞菌多重耐藥的相關性進行統計學分析。結果 在分離出的286株細菌中，檢出Ⅰ類整合子89株，檢出率為31.1%；Ⅰ類整合子陽性株對多種抗菌藥物的耐藥率明顯高于整合子陰性株。結論 銅綠假單胞菌的耐藥情況嚴重，Ⅰ類整合子是銅綠假單胞菌多重耐藥的重要因素。

銅綠假單胞菌； Ⅰ類整合子； 多藥耐藥

銅綠假單胞菌是目前引起人類感染的最重要的條件致病菌之一，僅次于大腸埃希菌，在醫院感染中占了很重要的地位，特別是由于近年來抗菌藥物的廣泛應用，其耐藥情況日益嚴峻，對醫院抗感染的治療增加了難度。引起銅綠假單胞菌多重耐藥的原因多種多樣，其耐藥機制主要涉及整合子、外膜通透性障礙、作用靶位改變、產生滅活酶、形成生物膜和主動外排泵系統等，而整合子高效的整合和表達作用使其在細菌耐藥傳播中起著重要的作用[1]。目前發現的整合子中與細菌的耐藥機制有密切關系的主要有3類，其中Ⅰ類整合子在多重耐藥的細菌中最為常見，并在耐藥性方面起著重要作用。因此本文通過對本院2013年臨床分離的286株銅綠假單胞菌進行耐藥譜研究和Ⅰ類整合子的檢測，進一步探討Ⅰ類整合子與銅綠假單胞菌耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株和鑒定 本實驗菌株均是本院2013年1～12月的初次分離株，共286例，采用VITEK-32全自動微生物鑒定儀進行菌種鑒定。

1.2 藥敏試驗 采用美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的標準方法(K-B紙片法)，由英國Oxoid公司提供的16種藥敏試紙對亞胺培南、美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢唑啉、頭孢他啶、慶大霉素、丁胺卡那霉素、復方磺胺甲噁唑、呋喃妥因、頭孢曲松等進行藥敏試驗。

1.3 設計引物與PCR擴增檢測Ⅰ類整合子 根據文獻和pubmed檢索設計intⅠ1引物：5′-GGG TCA AGG ATC TGG ATT TCG-3′，3′-ACA TGC GTG TAA ATC ATC GTC G-5′。通過對所收集菌株進行PCR擴增，電泳后檢測擴增產物并進行DNA測序。

1.4 統計學處理 全部藥敏結果采用世界衛生組織(WHO)推薦的細菌耐藥性監測軟件WHONET 5.4，計數資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 銅綠假單胞菌中Ⅰ類整合子的檢測結果 286例銅綠假單胞菌中檢出Ⅰ類整合子89例，檢出率為31.1%，見圖1。

圖1 銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子的凝膠電泳圖

2.2 286例銅綠假單胞菌的耐藥譜 見表1。所有菌株對亞胺培南和美羅培南敏感率最高，Ⅰ類整合子陽性株對多種抗菌藥物的耐藥率明顯高于Ⅰ類整合子陰性株，其中Ⅰ類整合子陽性株中的頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素和呋喃妥因全部耐藥。

表1 銅綠假單胞菌的耐藥譜

2.3 DNA測序結果 選取Ⅰ類整合子的陽性擴增產物2例純化后直接雙向測序，結果顯示，Ⅰ類子擴增片段大小為484 bp，與預期擴增片段大小相符，經GenBank數據庫同源性比對，與庫中的Ⅰ類整合子的同源性均為100%。

3 討 論

銅綠假單胞菌作為目前引起醫院感染的常見菌，可引起呼吸道病房、重癥監護室等重癥患者病區醫院感染的爆發[2]，但銅綠假單胞菌的耐藥率卻不斷升高，所以近年來對于細菌的耐藥問題已引起醫學界的嚴重關注。當務之急就是要找出引起耐藥的基因或傳播基因，深究耐藥的源頭。近年來國內外有大量的文獻報道，整合子可介導各種耐藥基因，可以在同種細菌菌株之間甚至不同種細菌菌株之間傳遞[3-4]，整合子在耐藥機制中就扮演著重要的角色，其中Ⅰ類整合子起著主要的作用。因此，有必要將本院銅綠假單胞菌感染的標本進行Ⅰ類整合子的檢測及耐藥情況分析。

本組通過對進行實驗的16種抗菌藥物的耐藥率的比較可發現，發現對亞胺培南(16.1%)和美羅培南(14.7%)的耐藥率最低，比孫珊等[5]報道的結果還低。而頭孢唑啉和呋喃妥因的耐藥率較高，達到70%以上；頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星、復方磺胺甲噁唑等的耐藥率都超過50%，常見的這幾種藥的耐藥率都如此高，給臨床的用藥選擇增加了難度。

在對留取的286例銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子的檢測中，總檢出89株，檢出率為31.1%，比國內其他地區的報道還低一點[6-7]，可能由于本院是中醫院，抗菌藥物與中藥的混合使用，與各地區的抗菌藥物的使用習慣不同和標本的類型不同引起。按照目前各地區的抗菌藥物的使用情況，隨著時間的推移，Ⅰ類整合子的檢出率也會不斷增高[8]。

對比Ⅰ類整合子陽性和陰性株的耐藥譜可發現，Ⅰ類整合子陽性菌株的頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素和呋喃妥因的耐藥率達100.0%；而環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率超過80%；其他的耐藥率也比Ⅰ類整合子陰性株的耐藥率高，具有統計學意義。由此可以推斷Ⅰ類整合子可能就是銅綠假單胞菌耐藥增加的重要原因[9]。而Ⅰ類整合子陽性菌株中的頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素和呋喃妥因全部耐藥，說明Ⅰ類整合子嚴重地影響著銅綠假單胞菌的耐藥情況，在以后的治療中必須非常注意是否為Ⅰ類整合子的菌株感染。

總之，由于銅綠假單胞菌的耐藥水平不斷增高，感染所導致的治療的難度也會越來越高。本文只研究了銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子所引起的耐藥水平，而其他更多的耐藥機制并未涉及[1]，因此，除了合理地選擇抗菌藥物的使用外，找出銅綠假單胞菌耐藥的機制則更為重要。

[1]宋玉蘭,趙麗,申子路,等.銅綠假單胞菌耐藥機制研究現狀[J].中華醫院感染學雜志,2010，20(6)：898-900.

[2]施夢萍,章可謂.臨床分離的銅綠假單胞耐藥性檢測[J].中國消毒學雜志，2010，27(4)：439-440.

[3]章清,魏麗,王金鐸.多耐藥銅綠假單胞菌可移動遺傳元件研究[J].中華醫院感染學雜志，2010，20(18)：2742-2745.

[4]杜娟.醫院感染銅綠假單胞菌的臨床分布及多重耐藥分析[J].中國煤炭工業醫學雜志，2013，16(1):29-30.

[5]孫珊,張莉萍.1 274株銅綠假單胞菌在臨床細菌感染中的分布及耐藥性分析[J].重慶醫學,2011，40(3)：226-228.

[6]姚慧琳,劉培明,陸士海,等.銅綠假單胞中整合子的分布及其可轉移耐藥性研究[J].中國抗生素雜志，2009，34(8)：S4-S6.

[7]黃金平.431株銅綠假單胞菌在臨床科室分布與耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志，2010，20(15):2317-2317.

[8]廖如燕，陳玲珍，周霓，等.廣東地區醫院分離銅綠假單胞菌整合子及其攜帶耐藥基因的研究[J].中國消毒學雜志，2012,29(3)：183-187.

[9]郭宇，王歡，張正.銅綠假單胞菌整合子與其多藥耐藥的相關性分析[J].中華醫院感染學雜志，2010，20(1):6-8.

Study on correlation between drug resistance spectrum and class Ⅰ integron in 286 strains of Pseudomonas aeruginosa*

CHENFu,LIYue-jun,ZHOUQiang△,LIAOHuan-lan,XUZhen-jie,CHENZhong-hua

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To clarify the role of class Ⅰ integron in multi-drug resistance of Pseudomonas aeruginosa by analyzing the resistance situation of 286 strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital in 2013 to 16 kinds of antibacterial drugs.Methods The drug susceptibility test was performed by the K-B test.The class Ⅰ integron gene was detected by PCR.The correlation between the class Ⅰ integron carrying rate and multi-drug resistance of Pseudomonas aeruginosa was statistically analyzed with chi-square test.Results In isolated 286 strains of Pseudomonas aeruginosa,89 strains were the class Ⅰ integron with the detection rate of 31.1%;the resistance rate to various antimicrobial agents in class Ⅰ integron-positive strains was significantly higher than that in integron-negative strains.Conclusion The drug resistance situation in Pseudomonas aeruginosa is serious.The classⅠ integron is an important factor in multi-drug resistance of Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa; class Ⅰ integron; multidrug-resistance

廣東省科技廳科研項目(2011B031800028)。

陳富，男，主管技師，大學本科，主要從事臨床檢驗工作。△

，E-mail:13631412228@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.007

A

1672-9455(2015)02-0157-02

2014-05-27

2014-10-23)